一、组织抽提:
1. 取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末
2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆
3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打
4. 冰上孵育5分钟
5. 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管
6. 加0.2 ml氯仿,震荡,冰上孵育5分钟
7. 离心<12,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管
8. 加0.5 ml异丙醇,震荡,冰上孵育5分钟
9. 离心<12,000g 4℃ 5分钟 弃去上清液
10. 加入1 ml 75%乙醇,震荡
11. 离心<7,500g 4℃ 5分钟 弃去上清液
12. 室温下使之变透明
13. 加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA( 可保存在液氮或低温冰箱)
14. 走RNA变性电泳观察18s,28s条带,分光光度计检测260/280吸光度比值,计算RNA浓度
二、RT反应体系(第一步):约20分钟
RNA 抽提物 | 5μl |
Radome 引物 | 2μl |
RNA sin | 0.5μl |
1. 65℃ 15分钟
2. 立即放入冰浴
RT反应体系(第二步):约2小时
RNA sin | 0.5μl |
10mM dNTP | 1μl |
5×RT 缓冲液 | 4μl |
25mM MgCl2 | 4μl |
AMV 逆转录酶 | 3μl |
1. 37℃ 1.5小时
2. 94℃ 5-10分钟
3. 反应物保存于-20℃或进行PCR
三1、PCR反应体系:约4.5小时
25mM MgCl2 | 2μl |
10×PCR 缓冲液 | 5μl |
10mM dNTP | 1μl |
上下游引物10pmol/μl | 2.5μl×2 |
CDNA模板 | 2.5μl |
ddH2O | 34μl |
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