RTPCR技术2

三：操作

１：反转录反应

按下表准备反应液

样品 体积 终浓度

５×反应缓冲液 10μl １×

dNTP混合液 1μl 0.2mM

下游引物 50pmol* 1μm

上游引物 50pmol* 1μm

25mM MgSO4 2μL 1mM

AMV反转录酶 1μl 0.1μ/μl

TflDNA聚合酶 1μl 0.1μ/μl

RNA模板 xμl**

去核酶无菌水 加至５０μl

２：滴加１－２滴去核酶的矿物油

３：在控温水浴或其它设备中48℃保温４５分钟

４：设定PCR参数，PCR循环以合成cDNA第二链及扩增

５：RT-PCR产物分析

反应产物上１％的琼脂糖凝胶电泳分析结果，对于对照样品，扩增条带为323bp。

６：扩增产物在－20℃保存。

注1：引物，５０pmol＝16.3ng×b,b:引物碱基数。对于对照样品上下游引物钧取3.3μl；模板，用103－106拷贝量的模板，或1pg-1μg总RNA，对于对照反应，选用对照模板量为2μl(106拷贝量)

2：RT-PCR能否有效地进行,依赖于模板mRNA的完整性和纯度。在操作中必须具备一个无RNA-酶的环境,实验过程中应该用消毒的离心管、吸液头,戴手套,用DEPC处理的水。如果要从核酸酶活性高的样品中分离RNA时,建议使用RNA酶抑制剂。

3：在使用此RT-PCR系统时,为了获得精确的实验结果,要求作模板的RNA,不管是总RNA、mRNA、还是合成的RNA,都要是无DNA的样品。系统中TflDNA聚合酶在系统规定的操作条件下,无反转酶活性,但是如果反应体系中含与模板有同样序列的微量DNA,则该酶会催化扩增出非实验所需的片断。

4：RT-PCR反应中模板RNA的最小需要量,与模板RNA和引物片断的类型有关,对于系统提供的对照RNA模板,每一反应所需的最小量为10的3次方分子(2.5Zeptomoles，2.5×10-25mole)。为了使RT-PCR实验能获得较好的结果,要求,对于总RNA作为模板,这在每一反应中其量应为10pg-1μg,而对于mRNA做模板则要求量为1pg-100ng。

5：在RT-PCR实验中,最好进行对照和空白对照反应,在进行对照反应实验时,反应体系中加入试剂盒提供的对照模板和对照上下游引物；在进行空白对照反应时,则采用灭菌的无DNA水代替RNA作为模板,用于反应体系。在实验中要特别注意防止各次实验之间样品与前次实验的残留核酸(DNA或RNA)的交叉污染。每次实验中扩增前的操作步骤应与扩增后的操作步骤最好有相互分开的工作区和取液器具。操作中最好使用能很好防尘的吸头。操作人员要戴上手套,并经常更换。实验中应用UNG或其他灭活技术处理以防止残留DNA被带入反应过程。

6：镁离子浓度

在RT-PCR反应系统中,由AMV逆转录酶和由TflDNA聚合酶催化的两步反应均需要镁离子,而这两步反应中所需的镁离子量且由反应体系中的核苷酸、寡聚核苷酸引物及模板的终浓度决定。反应体系中硫酸镁的使用浓度必须满足模板/引物的综合需求,虽然1-2.5mM的浓度的硫酸镁能基本满足大多数RT-PCR的要求,但镁离子浓度更进一步精确,将使逆转录和扩增过程灵敏度更高、专一性更强、质量更好。为了正确确定反应中所需镁离子的浓度,在正式实验前应先进行一系列平行实验,在这些平行实验中,在50μl反应液中分别加入1,2,3,4,5,6μl硫酸镁储液(试剂盒所带,25mM),然后比较各实验结果,以确定镁离子浓度。

7：引物设计

在操作中必须用特殊的引物来进行第一链的合成。这种引物与模板上一特定序列煺火,将模板上的某一段mRNA(而非整个样品mRNA)反转成cDNA。对于cDNA和基因组DNA的扩增差异来讲,前者的引物是与外显子而非内显子互补的。基因组DNA的扩增产物要比RT-PCR的产物大许多,这种长度上的差异不仅有助于在胶上将两者分开,而且更有助于cDNA的扩增产物的形成(因PCR在短片断的合成上更具优越性)。引物浓度是RT-PCR中应考虑的另一个引物方面的问题,我们建议开始时的引物浓度最好用50pmol(这样终浓度可为1μM)。

8：模板 温度及循环数

RT-PCR反应中并不要求模板变形,如操作人员想加这一步,则应经模板/引物混合物与其他反应液分开,单独对模板/引物在94℃变性2分钟(AMV千万不能参与变性,否则将失活),然后再将其加入到RT-PCR的其他反应液中,在48℃保温。在AMV/Tfl反应缓冲液中AMV的最适反应温度为37-48℃,我们建议操作温度最好采用48℃,应在此温度下,能最大程度的防止mRNA 的二级结构的形成,从而合成最为完整的cDNA。反转完成后我们建议在94℃保温2分钟,以打破RNA/ cDNA间的二级结构,并灭活AMV反转酶。有报道AMV必须灭活后才能保证Tfl等DNA聚合酶进行片断扩增。引物的序列是PCR扩增中各温度设定时首要考虑的因素。常规的扩增过程为变性(94℃),煺火复性(42-60℃),延伸(68℃),如引物有高的Tm值,则可提高上述的煺火复性(42-60℃)和延伸(68℃)温度,煺火温度越高,非特异性扩增越少,特异性扩增越多。另外如上游引物的Tm低,则应降低煺火复性温度,使引物与模板能很好的煺火。对于PCR循环数我们建议用40个,如模板RNA为稀有RNA,或量很少,则循环数可相应增加到45-50个循环