RTPCR实验原理及注意事项

一、实验方法原理

逆转录-聚合酶链反应 （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR） 的原理是：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

二、注意事项

1、在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂；

2、为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；

3、内参的设定：主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。

其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；

4、PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。

故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定；

5、防止 DNA 的污染： 采用 DNA 酶处理 RNA；在可能的情况下，将 PCR 引物置于基因的不同外显子，以消除基因和 mRNA 的共线性。