SDS裂解法提取质粒DNA实验

抗生素 氯霉素 氯仿 EDTA 乙醇 NaCl SDS STE Tris-蔗糖 溶菌酶 限制性内切核酸酶

琼脂糖凝胶 LB、YT 或 Terrific 培养液 硬质玻棒

一、材料

1. 缓冲液和溶液

(1) 用于质粒筛选的抗生素

(2) 氯霉素（34 mg/ml )

(3) 氯仿

(4) EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0 )

(5) 乙醇

(6) NaCl ( 5 mol/L)

(7) 酚：氯仿（1:1，V/V )

(8) SDS ( 10%，m/V )

(9) STE，冰预冷

(10) TE ( pH 8.0)

(11) Tris-蔗糖

2. 酶和缓冲液

(1) 溶菌酶（10 mg/ml )

(2) 限制性内切核酸酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶

4. 培养基

LB、YT 或 Terrific 培养液

5. 离心机和转头

(1) Beckman type-50 超速离心机或与其相当的离心机，Oak Ridge (橡树脊）塑料离心管（30 ml 带螺口盖，Nalgene 产）

(2) Sorvall GSA 转头或与其相当的转头

6. 专用设备

硬质玻棒

二、方法

1. 细胞的准备

(1) 在含适当抗生素的 30 ml 培养基（LB、YT 或 Terrific 培养液）中接种单一的转化细菌菌落或 0.1~1.0 ml 培养自单一转化子的对数晚期菌液。

(2) 剧烈振摇培养至细菌进入对数生长晚期（即 OD₆₀₀ 为 0.6 ) 。

为了确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大 4 倍；试管不宜盖紧；培养物应在剧烈振摇下培养。

(3) 在 2 L 三角烧瓶中含适当抗生素的 500 ml LB、YT 或肉汤（预热至 37℃，2L 培养瓶）中接种 25 ml 对数晚期菌液。37℃，剧烈振摇约 2.5 h ( 250 r/min）。

最终培养液 OD₆₀₀ 应为约 0.4。由于含不同质粒的不同菌株或同一苗株的生长速度不尽相同，因此有时达到合适密度的培养时间可能稍长或稍短于 2.5 h。

(4) 对于拷贝数低或中等的松弛型质粒，加入 2.5 ml 浓度为 34 mg/ml 氯霉素。培养液中氯霉素终浓度应为 170 μg/ml。

重要：对于高拷贝质粒，不必添加氯霉素。

(5) 37℃，剧烈振摇，12~16 h ( 250 r/min )。

(6) 从培养液中取 1~2 ml 于干净离心管中，4℃ 保存。其余于 4℃ 2700 g ( 对于 Sorvall GSA 转头为 4100 r/min）离心 15 min 收集细菌。弃上清。将离心瓶倒置，使所有上清流尽。

(7) 细菌沉淀用 200 ml 冰预冷的 STE 重悬。按步骤 6 离心，在离心瓶中保存细菌沉淀于 -20℃。

(8) 从步骤 6 保存的 1~2 ml 菌液中提取质粒 DNA。用适当的限制酶消化和琼脂糖电泳确定大量培养物中的质粒得到正确扩增。

这一步似乎显得多余，但提供了有价值的确证，从而防止产生难以挽回的错误和浪费大量的时间。

2. 细胞的裂解

(1) 将步骤 7 的冻存细菌沉淀置室温 5~10 min 融化，用 10 ml 冰预冷的 Tris-蔗糖溶液重悬，将悬液移入 30 ml 塑料螺口管中。

(2) 依次加入 2 ml 新鲜的溶菌酶溶液 ( 10 mg/ml ) 和 8 ml 0.25 mol/L EDTA ( pH 8.0 )。

(3) 温和颠倒管子数次以混匀悬液，冰上放置 10 min。

溶酶菌和 EDTA 联用可破裂细菌胞壁，并使外膜穿孔，所得原生质球尽管可渗漏，但在等渗的蔗糖溶液中是稳定的。

(4) 加 4 ml 10%SDS，立即用玻棒混匀，使 SDS 在细菌悬液中均匀分布。为减少释出的染色体 DNA 断裂，操作应尽可能温和。

(5) 一旦混匀，立即加入 6 ml 5 mol/L NaCl ( 终浓度 1 mol/L），再用玻棒温和彻底地混匀。置冰上至少 1 h。

3. 质粒 DNA 的回收

(1) 于 4℃ 离心 30 min，7100 g ( Beckman Type 50 转头为 30000 r/min)，以去除高分子质量 DNA 和细菌碎片。小心将上清移入 50 ml 一次性塑料离心管，弃沉淀。

如果细菌沉淀不密实，则重新离心 20 min，96000 g（Beckman Type 50 转头，35000 r/min），并将上淸尽可能多地转移至干净管中。弃去离心管中余下的黏稠液体。

(2) 上清用酚：氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次。

(3) 将水相转移到 250 ml 离心瓶，加 2 倍体积（约 60 ml ) 乙醇，混匀，室温放置 1~2 h。

(4) 收获质粒：4℃ 离心 20 min，5000 g ( Sorvall GSA 转头为 5500 r/min 或 Sorvall HS4 水平转头为 5100 r/min)。

对于此步，水平转头比角转头好，这是因为其可将质粒聚集于瓶底而不是布满管壁。

(5) 弃上清，室温下用 70% 乙醇洗沉淀和管壁，然后按步骤 4 离心。

(6) 尽可能将乙醇倒尽，将离心瓶倒置于一叠纸巾上，使乙醇流干。用真空抽吸器抽干离心瓶壁上的乙醇小滴。倒置离心瓶直至无乙醇残留。这时沉淀应保持湿润。

(7) 用 3 ml TE ( pH 8.0 ) 溶解湿润的质粒沉淀。

(8) 用商品化树脂或用 CsCl-溴化乙锭等密度梯度离心进一步纯化粗制的质粒 DNA。

大质粒（>15 kb ) 容易在纯化质粒的多次聚乙二醇沉淀中产生缺口。

(9) 依次用限制酶消化和凝胶电泳鉴定质粒的结构。