SouthernBlot实验原理及方法

实验原理：

Southern Blot是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量.

基本方法及主要步骤：
Southern印迹杂交的基本方法包括四部分，以下以植物southern印迹杂交为例。
　　（1）植物基因组DNA提取；
　　（2）DNA的限制性内切酶酶解、电泳和Southern转移；
　　（3）探针的标记和纯化；
　　（4）杂交、洗膜、检测以及去除膜上探针。

主要操作步骤：
　　1．琼脂糖电泳
　　（1）取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要10～20μg；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要30～50μg。
　　（2）酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳。
　　（3）电泳结束后，EB染色，长波紫外线下观察电泳结果及照相。
　　2．印迹转移
　　（1）切胶并作标记（左下角切除），以便于定位，然后将凝胶置于一容器中。
　　Southern印迹杂交转膜示意图（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置1h 使之变性，不间断地轻轻摇动。
　　（3）将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30 min，不间断地轻轻摇动。更换中和液，继续浸泡15 min。

　　（4）将滤纸，硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜）剪成与胶同样大小，NC膜浸入转移buffer中平衡30 min。
　　（5）按右图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。
　　（6）虹吸转移12-16h。
　　3．固定DNA
　　（1）取出转移后的NC膜，用滤纸吸干NC膜，NC膜光面朝上平铺于变性液中变性5min。
　　（2）用相同的方法将NC膜平铺在中性液上，中和两遍，每遍5min。
　　（3）将膜夹在两张干燥滤纸间，80℃烘烤1-2h。
　　4．预杂交
　　（1）将膜浸入5×SSC 中2min，将膜放入干净的塑料袋中。
　　（2）将预杂交液事先在65℃ 预热，然后将10 ml 预杂交液加入袋中，封口。
　　（3）65℃预杂交1h 以上，不时摇动。
　　5．杂交
　　（1）取出杂交袋，剪去一角去除杂交液后，加入5ml杂交液及5μl 变性探针，排除气泡后封口。
　　（2）将杂交袋放入65℃ 水中杂交过夜。
　　6．按下列条件洗膜
　　2×SSC, 0.1%SDS 50ml 室温 5min /2次
　　0.1×SSC, 0.1%SDS 50ml 65℃ 15min /2次
　　7．免疫酶联检测
　　（1）偶联反应
　　①用中和液 洗膜2min，室温。
　　②用封闭液50ml洗膜30min，室温，轻摇。
　　③用中和液将稀释抗体-Dig –Ap 至750 mU/ml ，将膜封入杂交袋，加入5 ml稀释抗体轻摇50min。
　　④用中和液 50 ml洗膜，10min ×2次，室温，轻摇，除去未结合的抗体。
　　（2）显色反应
　　①用平衡液20 ml平衡膜2min。
　　②将膜装入杂交袋中，加入5ml显色液，避光30min 左右，当出现颜色时不要晃动。
　　③用TE洗膜终止反应。
　　④80℃烤干。
主要应用
　　1.遗传病诊断
　　2.DNA图谱分析
　　3.PCR产物分析