T克隆绿色荧光蛋白（GFP）基因实验

【原理】

经TaqDNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个A。正是基于这一原理，pGEM-T质粒经EcoRV切成平端后，在开口端加上一个T制成T载体，一方面避免了自身环化，另一方面由于T-A互补，从而提高了T载体与PCR产物之间的连接效率。由于T-A克隆只需纯化PCR产物，因而操作较为简便。

pGEM-Tvector含丝状噬菌体f1的复制起始区，用于产生环状ssDNA；含有T7和SP6RNA聚合酶启动子；在多克隆区域具有编码β-半乳糖苷酶的基因(LacZ)，插入失活α-肽可在指示平板上通过蓝、白菌落直接筛选重组菌落。

转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（R-，M-）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源DNA分子的细胞）。

实验采用CaCl2法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。

pGEM-TVector图谱:
pGEM-T多克隆位点的序列：
【试剂与器材】

1.绿色荧光蛋白基因PCR产物，浓度为5ng/μl。

2.T4连接酶（购买Taq酶有配套的10×buffer）。

3.10×buffer浓度（购买T4连接酶有配套的Buffer）:

（66mmol/LMgCl，660mmol/LTris-Cl(pH7.6)，100mMDTT，1mMATP）。

4.消毒三蒸水
5.LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。

6.LB固体培养基LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。

7.0.1mol/LCaCl2高压灭菌消毒或过滤除菌。

8.氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。

9.大肠杆菌DH5α此为DNA扩增菌。

10.超净工作台

11.高速冷冻离心机

12.恒温摇床

13.恒温箱

14.恒温水浴箱

15.消毒离心管

16.消毒tips

17.玻璃培养皿直径90mm

18.玻璃涂布器和95%乙醇

19.标记笔

20.各种国产或进口移液器(10，20，100μl)

21.消毒的0.2mlPCR管。

【操作步骤】

1.细菌感受态细胞的制备

将DH5α和BL21（DE3）菌种分别划线于LB琼脂板上，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于5mlLB培养基中，37℃振荡培养培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有100mlLB培养基的烧瓶中，37℃剧烈振荡培养至约2～3h，待A600值达到0.3～0.4时将烧瓶置于冰浴10～15min。将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的50ml离心管中。4000×g，4℃离心10min，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。加预冷的已过滤除菌的0.1mol/LCaCl2重悬菌体，置冰浴30min。4000×g，4℃离心10min，弃培养基。再加4ml预冷的0.1mol/LCaCl2，轻轻重悬菌体，置4℃冰箱12～16h。

2.PCR产物与T载体连接

在0.2ml或0.5ml反应管中加入下列成分:

pGEM-T50ng

纯化的PCR产物10-50ng

T4连接酶2-3weissunits

10×连接缓冲液1μl

补超纯水至总体积为10μl，常温下放置30分钟以上；也可以16℃或4℃过夜。

3.重组子的转化

在无菌条件下按每管取100μl新鲜感受态细菌置于无菌的1.5ml塑料离心管中，共2管，分别加入连接产物和消毒水(作阴性对照)各5μl，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。42℃，热休克90s，中途不要摇动离心管，每管加800μl无抗生素的LB培养基，于37℃空气摇床中以150r/min速度振摇45min，使细菌复苏。每管取200μl加至含氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置20min，使液体吸收，然后37℃倒置培养12～16h至单菌落形成。