T细胞增殖分析的人气之选

　　对免疫学家而言，细胞增殖通常是T细胞受刺激的反映。受到刺激的T细胞产生它们自己的克隆副本，时刻警惕着特定抗原的再次来袭。

　　对于细胞增殖的分析，目前一般分为两大阵营。在第一个阵营中，研究人员依赖某些试剂来区分静止和分裂的细胞。这些试剂包括核苷类似物(如BrdU)、DNA染料(Hoechst和PI)，和细胞周期调控蛋白(如Ki-67)的抗体。有时，它们也能确定细胞周期的阶段。

　　第二大阵营则更直接地表明细胞自标记起共分裂了多少代。在此，细胞被标记上永久连接的染料。当细胞分裂时，染料也随之分裂，信号强度减半，这样就能了解细胞分裂了多少代。不过最多就6-8代，之后，信号通常太暗淡，难以与自发荧光区分开。下面就让我们来看看这些分析的优势与不足。

　　流式来帮忙

　　在流式细胞分析中，荧光标记的细胞排队通过流式细胞仪。仪器激发荧光基团，并定量特定波长下的荧光。荧光基团可由细胞的DNA编码(如GFP)，也可与抗体结合，或与特定的细胞组分发生反应。

　　流式分析不仅能让细胞被一一分析，“这也是一种非常强大的技术，让我们能一次测定许多不同的性质，”Robert Balderas谈道。他是BD生命科学部门负责流式细胞仪开发的副总裁。“作为一个平台，它让我们能查看细胞的大小和粒度，细胞上有什么，细胞内有什么。”

　　Balderas认为，更重要的是，流式细胞分析给了我们一个大海捞针的机会。研究人员可以利用此技术发现异质群体中独特的细胞类型，例如对分化标志物染色，对细胞表面活化标志物染色。此类免疫分型不仅能够区分Th1、Th2和Treg细胞，还能确定每个亚群的标志物有何不同。

　　染料选择多

　　据Roswell Park癌症研究所的肿瘤学教授Paul Wallace介绍，追踪T细胞增殖的常用方法是将荧光基团与细胞内的蛋白质相连接(蛋白质染料)或让荧光基团插入细胞膜中(细胞膜染料)。

　　蛋白质染料的代表是羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)，这是一种不带电荷的染料，很容易穿过细胞膜。一旦进入细胞，CFDA-SE被内源性的酯酶裂解，产生反应性的醛基，不加选择地与蛋白质上的氨基结合，从而标记蛋白质。在蓝光的激发下，CFDA-SE发出绿色荧光。不过，最近也有一些类似的蛋白质染料被开发出，它们有着不同的光谱特性，可以与CFDA-SE可能干扰的荧光试剂配合使用。

　　CFDA-SE标记细胞的荧光非常稳定和均匀，细胞每分裂一次，荧光强度就减弱一半，这样通过流式细胞仪检测就能检测出没有分裂的细胞。整个标记过程也相当简单。由于化合物只与蛋白质的一小部分相互作用，故它对细胞功能的影响似乎不大。不过爱因斯坦医学院的 Steven Porcelli教授也指出，可能还是有一定的影响。因此他建议优化CFDA-SE的浓度。

　　细胞膜染料的代表是Sigma-Aldrich的PKH系列，但其他制造商也提供具有不同光谱特性的版本。对于PKH系列染料，极性的荧光头部基团与长长的碳氢尾部相连，让染料能迅速插入脂双层，并稳定但非共价地保留在细胞内。目前较为常用的是PKH2和 PKH67(绿色)和PKH26(红色)。

　　细胞膜染料似乎对细胞功能没有影响，因此能获得非常明亮的细胞。Wallace指出，它们是亲脂性的，只是想进入膜。这些染料也可用于动力学研究，而不像蛋白质染料，需要一天才能稳定。不过，这个过程也挺麻烦，如果做不好，会导致细胞染色不均匀。 Wallace建议多实践几次。

　　体内 vs. 体外

　　细胞在体外染色之后，可刺激并体外培养，也可转移到动物宿主内，进行体内研究。然而，康涅狄格大学健康中心的助理教授Evan Jellison认为，并非所有研究都适合从动物中取出细胞，标记后再重新引入活体动物中。

　　在这种情况下，细胞必须在体内标记。研究人员通常掺入BrdU，通过注射或加入饮用水中，以确定细胞在pulse过程中是否复制了其DNA。不过，若要通过流式细胞仪来观察BrdU，首先必须透化细胞和核膜，然后变性并以荧光标记的BrdU抗体来检测DNA。

　　现在，研究人员还有一个选择，那就是Life Technologies的Click-iT® Plus EdU Alexa Fluor® 647 Flow Cytometry Assay Kit。他们可用胸苷类似物EdU注射动物，然后收集细胞，进行检测。EdU的检测是基于一个click反应 – 铜催化的叠氮化物与炔烃之间的共价反应。EdU中含有炔烃，而荧光检测试剂含有叠氮化物。据介绍，这种检测试剂非常小，比一般的抗体小100倍，因此不需要变性DNA，让整个过程更快、更简单。

　　当然，其他的方法也能确定T细胞是否对刺激有反应，如通过血球计数器对细胞进行计数，或测定3HdT的摄入，这些也是可靠的体外方法。然而，多参数的流式细胞分析不仅能够让我们确定细胞在受到刺激后是否增殖，还能了解哪些细胞增殖，它们经历了哪些变化。荧光试剂的饕餮盛宴让增殖分析既强大、又细致。