T淋巴细胞转化试验

一、 基本原理

T 细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。

淋巴细胞转化试验有形态计数法、MTT 法和同位素法三种。MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT 是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。小鼠脾细胞受到ConA 作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT 作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经盐酸─异丙醇溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD 值，测定波长570nm。根据OD 值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。

3H-TdR 掺入法：细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制，这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。一般来说，一个细胞周期可大致分为四期，即G1 期、S期、G2 期和M期。其中S期为DNA合成期，主要功能活动为DNA合成。3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷（[3H-methyl]thymidine），是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR就越多，因此，检测所掺入的3H-TdR就可反映细胞增殖的程度。因该方法有同位素污染问题，故我们实习中仍用MTT法。

二、 实验材料

1. ICR 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）

2. RPMI1640 培养液

3. Hank's 液

4. 刀豆蛋白A（Concanvalin A, ConA），用RPMI1640 液配成1mg/ml，分装小瓶，冷冻保存

5. MTT 1mg/ml

6. 2.5%碘酒、75%酒精

7. 无菌尖吸管和刻度吸量管

8. 无菌解剖器械

9. 96 孔平底培养板

10. 5%CO2培养箱（美国NAPCO公司产品）

11. 酶标测定仪 （美国BioRad 公司产品）

三、 实验方法

1. 小鼠脾细胞悬液的制备：

取一个灭菌的平皿，加入5ml Hank's液。颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏，放入平皿中，在钢网上研磨并过筛，制成细胞悬液。取出100μl用于计数。将其余细胞悬液移入一离心管中，离心1500rpm，7min，（或1000rpm，10min）弃去上清，用RPMI1640 培养液稀释，制成2.5×106 / ml的脾细胞悬液，然后加入ConA使每孔最终浓度为2μg/ml，同时做不加ConA的阴性对照孔。

2. 将上述细胞悬液加入96 孔平底培养板中，每孔0.1ml。

3. 将培养板放入含有5%CO2的37℃培养箱中培养48-72 小时，在培养结束前4-6 小时，于培养板各孔内加入1mg/mlMTT液，10μl/孔。370C培养6 小时。

4. 各孔内加入0.01M 盐酸—异丙醇110μl，30 分钟内（或加2%SDS 100ul/孔，过夜）用酶标测定仪测OD 值，测定波长570nm。

四、 实验结果

将实验组和对照组三个复孔的OD 值平均。

转化值=实验组的平均OD 值-对照组的平均OD 值。

五、注意事项

（1）由于本实验需要培养3 天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。

（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果