T4DNA聚合酶实验

实验材料 DNA
试剂、试剂盒 Trish·CldNTPMgCl2BSADTT
仪器、耗材 水浴锅
实验步骤 
一、50 μl 反应体积：

（1）50 mmol/l  Tris·Cl，pH8.0

（2）5 mmol/l  MgCl2

（3）5mmol/l  DTT

（4）100 μmol/l  4dNTP混合液

（5）50 μg/ml  BSA

（6）0.1 U  T4DNA聚合酶

（7）2 μg  DNA

（8）11℃温育20 min，加入2 μl 0.5 mol/l EDTA或75℃加热10 min以终止反应。

（9）反应体枳、4种dNTp的浓度、反应温度可依具体应用而变。
 
二、dNTp浓度的效应
 
1.  高浓度的dNTP在通常实验下可以增加聚合酶活性对外切酶活性的比值。

2.  在标记实验中，标记了dNTP的浓度降至1到2 μmol/l，但标记dNTP不能低于1 μmol/l 浓度，否则当dNTP耗竭时，会导致其外切酶活性对的降解。
 
三、度的效应
 
用T4 DNA聚合酶标记3’末端时，反应温度保持在11℃，在较髙温度下，其外切酶活性易降解DNA模板。

其他 
一、缓冲系统的相容性
 
许多限制性内切酶能在T4 DNA聚合酶的缓冲系统进行切割反应，同时，T4 DNA 聚合酶也能直接使用。

二、应用
 
1.  放射性标记DNA片段的3’末端，含5’凸出端的DNA片段及浓度为1~2 μmol/l 的适当［α-32P］dNTP，在11℃温育20 min。
 
2.  选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3’宋端，即所谓的“置换合成”。双链 DNA片段在dNTP存在下与T4 聚合酶温育，其3’末瑞的外切酶活性导致从 3’末端降解DNA，当补加4种dNTP后，可激活其聚合酶活性，延伸DNA镆板的3’末端。在T4 DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板时加入4种dNTP混合液，可获得最隹标记效果。

3.  变双链DNA的粘性末端成平端，便于平端克隆。在髙浓度4dNTP种存在下，酶促的 降解终止于双链区，类似地，如果末端存在5‘凸出，酶将延伸凹进陷的3’端直至与5’端平齐。在实际应用中，DNA与T4 DNA聚合酶和浓度各100 μmol/l dNTP在温育20 min。