TGFf3／Smad信号通路相关蛋白表达

尸检胰腺标本

Smad抗体 TGF-13R I抗体

石蜡切片 组织芯片构建仪

一、收集病例资料

收集2001年1月——2003年12月第二军医大学附属长海医院病理科资料较完整的手术切除及同期尸检胰腺标本计250例。复读全部病理切片，根据PanlN最新概念和诊断标准，检出切片中全部PanlN病灶，共计351灶，分布于156例中。这156例包括导管腺癌121例、慢性胰腺炎23例，正常胰腺12例。其中，男性93例，女性63例，年龄3O——8O岁，平均58.6岁。121例胰腺导管腺癌中，发生于胰头部的有92例，胰体尾的27例，全胰的为2例。病理上属于高分化的有21例，中分化68例，低分化32例。

二、组织芯片构建

找出存在PanlN病灶的HE切片和相应存档的组织蜡块，先在切片PanlN病灶处用记号笔作好标记，比对蜡块，在对应点同样作好标记。组织芯片构建参照Kononen等建立的方法，应用组织芯片构建仪（Tissue Arrayer，Beecher Instruments，Silver Spring，MD，USA）制备组织芯片。

流程如下：

1. 应用构建仪在预先制备的空白蜡块（45 mm x20 mm）中穿孔（直径2 mm，深度2——3 mm），然后在组织蜡块标记点处穿取组织（直径及深度同上），准确放入空白蜡块的小孔内，依次按序操作，直至完成，并加以记录。

2. 然后对制备好的芯片蜡块进行处理，使嵌入的组织条与蜡块密切融合。

3. 最后应用石蜡切片机进行连续切片。

三、免疫组化染色

2——4 m厚石蜡切片，免疫组化采用S-P法和EnVision二步法，用PBS替代一抗作阴性对照，DAB显色。Smad2、3、4、7抗体购自Santa Cruz公司，TGF.131、TGF.13R U抗体购自武汉博士德公司，TGF-13R I抗体购自Cell SignalingTechnology公司。

四、结果判定

染色结果参照有关文献的判定标准并略加修改，Smad2、3和TGF一131以胞质内出现明显棕黄色颗粒为阳性；Smad4、7则以胞质和（或）胞核内出现明显棕黄色颗粒为阳性；TGF-13R I，TGF.13RII以胞膜和（或）胞质中出现棕黄色着色为阳性。上述指标均以阳性细胞数>10％ 为阳性病例，阳性细胞数≤10％者为阴性病例。

五、统计学处理

数据采用SPSS统计软件行x2检验

本实验步骤参考《用组织芯片和免疫组化技术系统比较不同级别PanIN和胰腺癌组织TGF-13/Smad信号传导通路中相关蛋白表达》的内容