TNF的生物活性测定

1． 材料和试剂

1.1培养液A ：DMEM培养液添加10%的胎牛血清（FBS）。

1.2培养液B：DMEM培养液添加10%的胎牛血清（FBS）和终浓度为0.7--1μg/ml

的放线菌素D。

1.3 L929细胞株：鼠结缔组织纤维母细胞，来源于22天雄性C3H鼠皮下组织。

1.4 结晶紫染色溶液：0。05%结晶紫 (50mg结晶紫加入20ml乙醇,加蒸馏水定容至100ml)，蒸馏水稀释。

1.5 脱色液：（1）乙二醇独甲醚50%，蒸馏水稀释。

（2）乙醇50%，乙酸0.01%(V/V)，蒸馏水稀释。

1.6 胰酶：消化贴壁L929细胞。

1.7 半效稀释度TNF标准品：1000IU/ml。

2. 实验用具

超净工作台，细胞培养烘箱，酒精灯，显微镜，细胞计数器，微量移液器，细胞培养板，细胞稀释槽，酶标仪。

3. 操作步骤

3．1样板：弃L929细胞培养瓶中的培养液，加入800—900μl胰酶消化细胞，细胞收缩后，弃胰酶，加入4ml培养液A，吹打细胞，混匀，用细胞计数板在显微镜下计数，并计算所需细胞总数，培养液体积，将消化好未贴壁的细胞重新悬浮于完全培养液A，并调整细胞浓度为10×104/ml左右并将细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl,37°C，5%CO2培养过夜或24小时，待细胞贴满板壁80%以上时，方可加样。

3．2 样品处理和稀释：将待测样品和标准品用培养液B溶解至1 ml，（样品为冻干粉状）。如标准品为1000IU/ml，10倍稀释至100IU/ml作为起始浓度，样品则根据实际情况都做10倍梯度稀释，并以最低浓度定为起始浓度（以上操作均在24孔板中操作）。

从样品和标准品中的起始浓度中取200μl加入到96孔板A2-A12中，其余各孔均加入150μl培养液B，再从A2-A12中各取50μl，对 B-H各排进行逐级四倍梯度稀释。

3．3 加样：标准品和样品经稀释后，吸去已经培养好的细胞培养板中的上清液，每孔依次加样100μl，并在边缘未加样的各孔加入100μl培养液B，消除边缘效应，放入烘箱37°C，5%CO2，培养过夜。

3．4 染色和脱色：L929细胞培养过夜后，镜检在半数死亡孔到达D或E时终止反应，吸取上清，轻轻吹打2—3次，除去死细胞，每孔加入染色液30μl，静置5 分钟左右。

用流水轻轻冲掉染色液，每孔加入100μl脱色液脱色，轻轻摇动使脱色完全，然后于酶标仪570nm波长下比色，测O.D.值,并设对照。

4. 处理数据:在座标纸上以570nm O.D.值(双孔加样测两点值的平均)对稀释倍数做图,并以标准品的最低,最高O.D.之平均值做一平行于X轴的直线交各曲线,以各相应曲线与该直线交点在X轴上读出半效量的稀释度,按下式计算效价:
TNF成品活性(IU/ml)=标准品效价*(样品预稀释倍数/标准品预稀释倍数)*(标准品半效量稀释度/样品相当于标准品半效量的稀释度)