实验概要
本实验介绍了Western杂交的基本流程。
主要试剂
液氮,提取缓冲液(1 x PBS,10ug/mL Leupeptin,1 mM PMSF,5 mMBenzamidine. 2mM EDTA),转移缓冲液(39mM Glycine,48mM Tris,0.037% SDS,20%甲醇),PBST (1 x PBS,0.1% Tween20),封闭液(1 x PBST,5% skim milk),杂交缓冲液(1 x PBST,5% skim milk),一抗,二抗(HRP conjugated)
主要设备
研钵,高速离心机,电泳仪,蛋白电泳槽,PVDF膜,Whatman滤纸,转膜槽
实验材料
植物叶片
实验步骤
1. 蛋白提取
1) 取1-2片植物叶片液氮速冻,研磨成细小粉末。
2) 加入100ul提取缓冲液(1 x PBS,10ug/mL Leupeptin,1 mM PMSF,5 mMBenzamidine. 2mM EDTA)研磨直至均匀。
3) 14000 rpm于4℃离心10分钟,取上清。
2 . Western杂交
1) 配制成10-15%的SDS-PAGE胶,取10-20ug蛋白电泳。
2) 电泳结束后取下蛋白胶,浸泡于转移缓冲液(39mM Glycine,48mM Tris,0.037% SDS,20%甲醇)中。
3) 切一张与蛋白胶相同大小的PVDF膜,在膜左上角标记,用甲醇漂洗后浸泡于转移缓冲液中。
4) 切两张与蛋白胶相同大小的Whatman滤纸,浸泡于转移缓冲液中。
5) 按顺序先后组装转移装置:负极,滤纸,蛋白胶,PVDF膜,滤纸,正极。
6) 100伏电压转移45分钟。
7) 转移完成后取下膜用PBST (1 x PBS,0.1% Tween20)洗5分钟。
8) 将膜置于封闭液(1 x PBST,5% skim milk)中封闭2小时。
9) 用PBST洗膜5分钟。
10) 加入杂交缓冲液(1 x PBST,5% skim milk),再加入一抗,室温孵育2小时。
11) 用PBST洗膜3次,每次5分钟。
12) 加入杂交缓冲液(1 x PBST,5% skim milk),再加入二抗(HRP conjugated)室温孵育30分钟。
13) 用PBST洗膜3次,每次5分钟。
14) 用PBS洗膜5分钟。
15) 用ECL显色并照相。