WesternBlot的注意事项2

1.蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜（湿式转膜）

1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后，小心取出带有凝胶的玻板，用割胶刀沿下边缘小心撬开短板，按样品的多少切下合适大小的凝胶。浸泡在转膜缓冲液中5分钟左右，以平衡离子强度。视情况决定是否切角标记。

2）电泳结束前，应泡好3M滤纸2-6张均可（普通滤纸也可）和1张硝酸纤维素滤膜。

3）戴上手套按如下顺序安装转移装置：

      a.平放底部电极（阴极），放一张海绵垫片。

      b.在海绵垫片上放置1-3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸，逐张叠放，对齐，然后用一玻璃棒作滚筒以挤出所有气泡，必要时可滴加转膜液润湿。

      c.取出浸在转膜液中的凝胶平放于滤纸上。排除所有气泡。

      d.把硝酸纤维素滤膜放在聚丙烯酰胺凝胶上，在硝酸纤维素滤膜与聚丙烯酰胺凝胶之间不留有气泡。 

     e. 把最后1-3张滤纸放在硝酸纤维素滤膜上方，同样须确保不留气泡。其实，用玻棒给点压力很容易排除气泡。

      f.放上另一张或几张海绵垫片，盖上阳极板，夹紧。保证对凝胶有一定的压力。

4）连接电源。

      我做90KD的蛋白，电转移100分钟，电压100v。电转过程中，尽量给个低温环境，我放在冰水里转膜，也用内置的冰盒或者是放在4-8摄氏度的层析柜中。

5）断开电源，拆卸转移装置，逐一掀去各层。将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中，进行染色，可检查蛋白质转移是否完全。要观察膜上蛋白的情况可在丽春红中染色3-10分钟，然后蒸馏水冲洗

6）切去滤膜的左下角，以标记，如有预染MARKER也可不标。

7）杂交与显色： ① 封闭 ② 一抗孵育：分别与相应的抗体及内参照抗体孵育 ③ 漂洗：室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗3次以上，每次各10min。 ④ 与二抗孵育：与辣根过化物酶标记的二抗孵育 ⑤ 漂洗：室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗4次以上，每次各10min。 ⑥ ECL显像；⑦ 显影定影完毕.