发布时间:2018-01-12 16:01 原文链接: CRISPR/Cas9蛋白切割DNA过程中的调控和校验机制

  清华大学生命科学学院陈春来研究组在《Cell Reports》杂志发表了研究论文,题目为“The Conformational Dynamics of Cas9 Governing DNA Cleavage Are Revealed by Single-Molecule FRET”(利用单分子FRET揭示Cas9在DNA切割过程中的动态构象)。该论文展示了Cas9可以自发地在三种主要构象中转换,揭示了Cas9蛋白与PAM远端DNA/RNA双链相互作用可长程别构调控Cas9切割结构域的局部构象,这是Cas9切割靶标DNA之前的最后校验步骤。最后,该文提出了优化和设计高保真Cas9的新思路,即通过突变Cas9蛋白以影响这种长程别构调控机制,可提高Cas9的识别特异性。

  CIRSPR/Cas9是一种可以由一条单链sgRNA(single guide RNA)指导的利用Cas9核酸酶对靶向DNA进行特异性识别和切割的技术。由于其可以高效快捷地靶向切割DNA而被广泛地应用于基因编辑、基因表达调控、基因定位和成像等领域。但是,Cas9的脱靶效应严重阻碍了其应用。尽管有一些研究报道了通过改造Cas9和截短sgRNA来提高其特异性,但仍然缺乏对Cas9切割靶标DNA的详细分子机制的全面认知,因而难以对CIRSPR/Cas9的优化提供系统性的指导。

  单分子荧光共振能量转移技术(FRET)是检测生物大分子构象变化的有利工具。该研究通过在Cas9蛋白的特异位点上标记荧光团,基于全内反射荧光显微镜快速灵敏地捕捉单个Cas9分子的FRET效率变化以及在每个FRET状态的停留时间,以此反应Cas9的构象变化,并提供该过程中的一系列动力学参数。该研究发现,Cas9展现出三种构象状态,并可以自发的在这三种状态中自由切换。靶标序列的PAM远端与sgRNA的大于三个碱基的错配,导致Cas9的HNH结构域(核酸切割结构域)稍偏离了其正确切割位点,因而将其从切割活性态转化为非活性状态。而这种对错配的校验机制是Cas9蛋白与PAM远端DNA/RNA双链相互作用对其HNH结构域的长程别构调控来实现的。

Cas9蛋白切割靶标DNA的动态动态构象和校验机制模型

  通过对Cas9一些高保真突变体的研究,该文章证明了在Cas9/RNA/DNA三聚复合物中引入额外的能量损耗导致Cas9切割底物的能垒升高,从而提高了Cas9切割特异性。该文章为优化Cas9特异性提供了新思路,即通过减弱Cas9与PAM远端DNA/RNA异源双链的相互作用来提高切割能垒,从而达到提高特异性的目的。

  清华大学生命科学学院陈春来研究员为本文通讯作者。清华大学生命学院CLS项目三年级博士生杨梦铱,清华大学生命学院三年级直博生彭思佳为共同第一作者。本工作获得了北京结构生物学高精尖创新中心、清华-北大生命科学联合中心及国家自然科学基金委的经费支持。

相关文章

研究发现基因技术有望提高农作物产量

英国和美国研究人员首次通过田间试验证实,利用基因技术增加植物叶片中一种天然蛋白质的产量,能显著促进植物生长,有望成为农作物增产新方法。植物通过光合作用将二氧化碳和水转化为有机物,并释放出氧气,但光合作......

清华大学国际纳米光电子学研究中心成立

5月20日上午,清华大学国际纳米光电子学研究中心(以下简称“中心”)成立仪式暨纳米光电子学学术报告会在清华大学举行。清华大学副校长王希勤教授,中心学术委员会名誉主任、清华大学电子系教授周炳琨院士,中心......

QS世界大学排名发布,清华、北大排位齐升

伦敦6月6日电英国QS全球教育集团6日晚在伦敦发布了第十五期《QS世界大学排名》,中国大学中排名最高的清华大学从世界25位升至第17位,北京大学则从38位升至30名。本次《QS世界大学排名》显示,中国......

清华大学贺克斌当选20162017绿色中国年度人物

  分析测试百科网讯6月5日,在生态环境部与湖南省政府联合主办的六五环境日国家主场活动上,清华大学环境学院院长贺克斌被评为2016-2017绿色中国年度人物。贺克斌院士长期致力于大......

科研疲劳感与科研寿命

对于科研寿命问题,有人说博士毕业以后5年,水平就很差了。言外之意,读博士期间,不论状态、条件,对于科研前沿的跟踪等等,容易出成果。图片来源网络可一旦博士毕业,比如说10年以上,估计都在40以上。如果说......

高校实验室的新使命与新突破

  5月26日,2018中国国际大数据产业博览会在贵阳开幕,91家科技集团及企业一起亮相数博会。其中,大数据商用神经机器翻译技术、AI智能平台新型图计算技术、人脸大数据系统、大数据......

2018年5月CRISPR/Cas最新研究进展

基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称,Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRIS......

细胞自噬关键蛋白突变可延寿

或是哺乳动物“抵抗”老化的有效机制据英国《自然》杂志5月30日在线发表的一项老化学最新成果,美国科学家团队开展的小鼠实验显示,一种对细胞自噬过程至关重要的蛋白质发生突变后,可延长小鼠的健康期限和寿命。......

南京大学,中科院发文:发现新的膀胱癌侵袭转移蛋白

来自南京大学模式动物研究所,附属鼓楼医院泌尿外科系,中科院上海药物研究所等处的研究人员发表了题为“Wnt7aactivatescanonicalWntsignaling,promotesbladder......

新方法有望缓解化疗导致的疼痛

美国研究人员29日说,他们发现一种能够从根源上阻断疼痛的新方法,有望缓解因癌症化疗导致的疼痛。发表在美国《细胞报告》杂志上的新研究显示,向小鼠脊髓中注射一种天然蛋白质“载脂蛋白A-I结合蛋白”,可抑制......