NatureCommunications：第二代的锌指核酸酶技术

　　Sangamo Therapeutics公司的研究人员上周五在《Nature Communications》杂志上发表题为“Diversifying the Structure of Zinc Finger Nucleases for High-Precision Genome Editing”的文章，展示了其第二代的锌指核酸酶（ZFN）技术。

　　据Sangamo介绍，这些改进使得ZFN的多样性增加到64倍，从而有望对特定基因组位点进行高度精确的编辑。文章的通讯作者Edward J. Rebar博士是Sangamo的高级副总裁兼首席技术官，第一作者是David Paschon博士。

　　Paschon博士及其同事通过一系列蛋白质改造工作，开发出新的ZFN结构。这些改造包括颠倒DNA结合结构域和核酸酶结构域的顺序，以及运用新的接头（linker）跳过相邻锌指之间的碱基。通过这种结构多样化的策略，他们试图大幅度提高ZFN的靶向精确度。

（图片来自原文，红色部分为接头）

　　研究人员开发出一系列新接头，能够跳过锌指-锌指以及锌指-FokI切割结构域之间的碱基。他们报道称，这些改造使得ZFN结构的数量增加到64倍，能够实现任意位点的靶向切割。他们还评估了30种新结构，确定其中97%为活性核酸酶。

　　“我们的研究表明，我们的接头元件能够与现有的锌指结合，以接近1.0的密度靶向任意基因组片段，也就是说，ZFN能够靶向几乎每一个碱基。同时我们还表明，这些结构改进有望显著提高ZFN的靶向精确度，”研究人员写道。

　　让ZFN更有吸引力

　　同为基因编辑技术，人们不免将ZFN与CRISPR进行比较。一直以来，人们对ZFN的批评包括与CRISPR相比成本太高、速度太慢，以及开发高质量基因编辑产品的门槛过高。为此，Sangamo一直致力于缩短ZFN的开发周期。

　　“这种新结构显著提高了我们的靶向能力，将确保我们能够靶向最佳序列窗口，实现治疗应用。这说明了我们ZFN基因组编辑技术的多功能性，”Rebar博士谈道。

　　“在开发治疗用的核酸酶时，关键要求是能够定位临床效果最佳的双链断裂。在许多情况下，这一考虑使得最佳切割目标只能限制在狭窄的窗口。因此，提高靶向精确度一直是人们长期关注的问题，”Rebar补充道。

　　此前一个月，Sangamo宣布了利用ZFN技术治疗粘多糖贮积症（MPS）的I/II期临床试验的中期结果。尽管研究证实了疗法的安全性以及关键酶的表达，但没有取得公司期望的效果。

　　“它的确在发挥作用，但不足以带来临床受益，”Sangamo的CEO Sandy Macrae说。这些中期结果导致Sangamo的股价大幅下跌，从12.02美元跌至8.31美元，之后才逐渐反弹。

　　为人们带来更多选择

　　在这项研究中，Sangamo的研究人员表示，他们开发出新的接头，能够将FokI核酸酶结构域与DNA结合锌指结构域的N端连接，而以往只能与锌指结构域的C端连接。据介绍，这种设计产生了三种替代的ZFN二聚体，让设计ZFN时的选择增加到四倍。

　　同时，新的接头也允许相邻锌指之间的碱基跳跃。这样，经过改造的锌指就能够与部分移位的DNA序列相结合，同时保留相同的切割位点。如此一来，人们的设计选择又增加到16倍。

　　“将这两项改进纳入我们的ZFN平台，使得在任何目标位点进行有效基因组编辑的ZFN设计选项增加到64倍，”研究人员报告称。他们表示，这些新型结构在三种治疗应用中表现出出色的效率、精确度和特异性。

　　未来，这种接头也有望应用在TALENs、FokI-dCas9和Cas9等碱基编辑器中，以改善这些系统的性能。