发布时间:2018-03-13 16:50 原文链接: 把色谱柱加热到80℃会发生什么?

色谱柱加热到80℃会发生什么?


Espresso系列

~第二弹~


大家有没有想过,把一支色谱柱加热到80℃会发生什么。。。为了好奇的同学们,YoYo老师今天将为大家带来Espresso系列第二弹~


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PS: Espresso系列是由大阪曹達日本实验室提供的干货数据,不定期更新嗷~



 

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Proteonavi S5的溶出行为2 & 3

~与他社色谱柱的比较柱温80℃下的耐久性及峰形考察


Keywords :Proteonavi, 肽类, 缓激肽, 后叶催产素, 血管紧缩素II, 神经降压素, 血管紧缩素I, 环孢菌素A, 表面活性肽, 0.1 vol% HCOOH, 柱温80℃, 耐久性, 峰形

~与他社色谱柱的比较~


ProteonaviS5是一款以孔径为30 nm的硅胶作为基材、键合C4基团的蛋白质・肽类化合物分析色谱柱。


上回的Espresso中介绍了以6种蛋白质作为样品,将Proteonavi S5与他社色谱柱进行溶出行为的比较的试验。(Proteonavi S5的溶出行为1~与他社色谱柱的比较~)


本次,我们以5种肽类化合物(缓激肽、后叶催产素、血管紧缩素II、神经降压素及血管紧缩素I)作为样品,将Proteonavi S5与一款填料表面带有正电荷的他社杂化型色谱柱(孔径13 nm、粒径3.5 μm)的溶出行为进行比较,所得结果见图1。


图1 两款色谱柱分析所得色谱图


其中,流动相条件为添加0.1 vol%甲酸的水-乙腈系统,在梯度条件下进行分析,对这两款色谱柱进行了溶出行为的考察。


如图1,他社色谱柱对5种肽类化合物的整体保留较弱,且缓激肽峰未能得到确认(被吸附而未能溶出);与此相对,Proteonavi S5对这5种肽类化合物均得到了良好的色谱峰形及充分的保留与分离。

~柱温与溶出行为~


对肽类化合物进行分析时,有提高柱温的做法。例如,《第17改正日本药局方》中,环孢菌素是在柱温80 ℃附近的一定温度下进行分析的。


在此,以环孢菌素A作为原料,在等度条件下对色谱柱柱温变化及相应的溶出行为进行了考察。图2为所得结果。

环孢菌素A (M.W. 1202.6)

Cyclosporin A

图2 柱温与环孢菌素A溶出行为的关系


如图2,随着柱温的上升,环孢菌素A的保留逐渐减弱,峰形也愈发尖锐。


一般,与小分子相比,大分子的扩散速度较慢,因此色谱峰形有展宽的趋势,而设定较高的柱温可以使峰形变得尖锐。


就像这样,常规情况下,在对肽类化合物进行分析时,设定较高柱温可以使分析时间缩短,并提高定量准确性。(敲黑板!)

~80℃下的耐久性考察~


接下来,在柱温80 ℃条件下对Proteonavi S5的耐久性进行了考察。


图3为首次进样与连续进样第500针所得色谱图,图4为进样500针的环孢菌素A保留时间维持率(%)。


图3 首次进样和连续500次进样所得色谱图


图4 环孢菌素A的保留时间维持率(%)


如图3、4,对Proteonavi S5进行80˚C条件下的连续耐久性试验,在连续500次进样过程中(通液时间共计250小时),环孢菌素A的峰形几乎没有变化(理论塔板数N及对称因子S),同时,保留时间维持率近乎100%(首次进样与第500次进样对比,具体数值为99.4%)。


综上,Proteonavi S5色谱柱即使在80 ℃的高柱温条件下也能得到非常稳定的分析结果。


*耐久性评价方法是将首次进样的保留时间视为100%,将连续进样第500次的保留时间与其对比,计算维持率(%)。


*理论塔板数、对称因子的计算方法根据《第17改正日本药局方 解说书》进行。


对于环孢菌素A这样的大分子化合物,随着柱温的上升,其扩散速度加快,因而峰形会更尖锐。


进一步,针对提高柱温的效果,以环状肽类化合物表面活性肽(M.W. 1036.3)作为分析对象,将柱温分别设定为40 ℃和80 ℃进行分析,图5为分析所得结果。


表面活性肽 (M.W. 1036.3)

Surfactin

图5 柱温40 ℃及80 ℃条件下

对表面活性肽的分析色谱图


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