产研结合的典范：苦味素从科学发现到产业转化之路

　　《韩非子·外储说左上》有云 ：“夫良药苦于口，而智者劝而饮之，知其入而已己疾也”，良药苦口由此而来。最近，国内研究团队揭开了这类“苦口良药”的神秘面纱，成果相继发表在Nature Genetics（2013）、Science（2014）和Nature Plants（2016）等国际知名学术期刊上。研究者通过研究黄瓜发现：黄瓜苦味正是由三萜化合物葫芦素C导致的，葫芦素是一类高度氧化的四环三萜化合物，仅在葫芦科植物中（黄瓜、西瓜和甜瓜等）发现，苦是这类化合物最显著的特点，因此，葫芦素也叫苦味素。极低量的葫芦素（0.1 mg/L）就能引起明显的苦味，比典型的苦味剂咖啡因还要苦100倍左右。

图1.苦味素的来源-黄瓜

　　苦味素的发现对黄瓜育种和抗肿瘤药物开发具有重大的意义。植物的生长面对各种外界生物胁迫和非生物胁迫，极苦的苦味素是最佳的防御武器，可用来抵御病虫害的侵入。因此，苦味素是保护植物的 “绿色农药”。科学家通过黄瓜功能基因组研究和代谢组学研究发现，可以通过控制黄瓜叶片和果实中苦味素差异积累，培育出叶苦果实不苦的超级优良黄瓜品种。

　　在印度，极苦的野生黄瓜果实和叶片除了被用作泻药，还被用于治疗各种炎症。现代医学研究发现，甜瓜瓜蒂中的苦味素被提取出来并开发成治疗肝病的有效药物。近年来新发现的苦味素药用价值引起了人们的关注，苦味素对于肿瘤的治疗具有非常好效果。由于黄瓜中苦味素含量极低，因此通过解析苦味素代谢通路和合成生物学技术，提高苦味素的含量对于产业化苦味素应用于临床肿瘤治疗具有非常重大的医学意义。

　　苦味素是一种次生代谢物，属于是代谢组学的研究范畴。什么是代谢组？ “基因组反应了可能将要发生的事情，转录组反应了将要发生的事情，而代谢组反应了正在或者已经发生的事情”。生物体的表型性状是由代谢物的积累直接体现的，如水稻在旱胁迫过程中，水稻叶片ABA的含量会明显提高；当花青素的含量在西红柿果实中过量积累时，西红柿的果实颜色将由红色变成紫色；长春花长期以来被视为最有效的抗癌植物材料之一，而其中有效的抗癌活性物质是长春花碱（一种生物碱）。因此，植物功能基因组的研究最终都会落实到代谢组与表型组研究中来。

图2.代谢组是植物性状的最终体现

　　苦味素的发现，是我国科学家由基础科学研究到产业化应用的成功典范，也是基因组与代谢组多组学、多学科整合的成功案例。怎样才能将“基因组-转录组-代谢组”系统的结合起来，开展基础科学研究、技术转化及育种呢？今天小编将系统性的介绍黄瓜功能基因组研究如何从最初的基础科学研究到新品种选育以及抗癌药物研发的科学故事。

图3.系统生物学研究内容

基础研究：从无到有，由小到大的科研之路

　　1.黄瓜核心种质资源库的构建

　　研究团队通过搜集世界各地的黄瓜种质资源共3300多份材料进行了播种和性状调查。经过前期设计的23对SSR引物，对3300多份材料进行了指纹图谱分析（如图4），根据指纹图谱，分析了世界黄瓜系谱的演化历史，挑选了有代表性的黄瓜材料115份，作为黄瓜的核心种质资源库，可代表所有黄瓜资源 77.2%以上的遗传多样性，核心种质资源库将为黄瓜育种提供新的材料平台。

图4.黄瓜核心种质资源的构建和评估（2012，Plos One）

　　2.构建黄瓜基因组的HapMap图谱

　　通过第二代高通量测序技术完成上述挑选的115个黄瓜品系重测序，并对一个野生黄瓜进行了从头测序。基于这些重测序数据，构建起一个单核苷酸分辨率的黄瓜遗传变异图谱。将黄瓜群体分为了4个分化明显的群体，包括黄瓜的野生祖先印度群体，及其衍生亚群：西双版纳半野生群体、东亚栽培群体和欧洲栽培群体（如图5）。同时，该研究还发现了一个西双版纳黄瓜特有的突变，该突变导致了编码β-胡萝卜素羟化酶的基因是去功能，从而使得西双版纳黄瓜在果实成熟期因不能降解β-胡萝卜素而呈橙色。这一发现为培育营养价值更高的黄瓜新品种提供了分子育种思路。

图5.115份黄瓜核心种质重测序材料的群体结构分析（2013，Nature Genetics）

　　3.黄瓜基因表达谱研究

　　完成基因组测序后，为了进一步研究黄瓜基因表达水平的差异，该团队提取了10个黄瓜组织的RNA进行转录组研究（如图6），这些数据一方面提高了黄瓜基因组基因注释的可靠性和完整性，另一方面也发现了与黄瓜的性别分化、卷须发育和单性结实等相关的重要基因 300多个，进一步丰富了黄瓜功能基因研究。

图6.黄瓜unigenes GO富集分析（2010，BMC Genomics）

　　4.黄瓜果实品质等重要农艺性状相关基因的挖掘

　　利用重测序结果挖掘了约 1500 个驯化相关基因，阐明了人工驯化和迁移对黄瓜基因组的影响。通过全基因组关联分析，发现了决定黄瓜性别重要性状的关键基因（如图7），为进一步研究基因功能提供了重要信息。黄瓜这种不寻常特性是由一个30kb大小DNA片段的拷贝数增加引起，这段重复序列与全雌性高度相关。对全雌花植物来说，有很大的农业生产潜力。这些基因组结构的变异成为将来研究黄瓜基因功能的重要资源，并为充分利用结构变异改良作物，提供了理论基础。

图7.一段30.2Kb重复序列决定黄瓜全雌性表型（2015，Plant Cell）

　　5.黄瓜苦味素合成和β-胡萝卜素合成的分子机制

　　完成基因组和转录组等研究后，黄瓜的品质性状研究（代谢组）成为下一个需要突破的研究方向，代谢组是植物农艺性状和蔬菜营养功能的直接体现。基于前期功能的研究和后续代谢组技术的应用，科学家发现并证明了控制黄瓜苦味素合成的基因信息：控制黄瓜苦味素合成的关键基因簇，是由5个串联基因组成，其中三萜合成酶基因的关键突变导致了黄瓜苦味素的合成与否，进一步通过生物化学实验，证实了该基因簇具有合成苦味素的功能。同时，利用生物信息学筛选、及高效液相色谱检测（代谢组检测）等生化分析发现了β-胡萝卜素水解酶基因的关键突变位点（如图 8），阐明了β-胡萝卜素在西双版纳黄瓜中大量积累导致果实颜色呈现橙红色的分子机制，可用于后期“金色黄瓜”的育种。

图8.全基因组关联分析发现β胡萝卜素水解酶基因（2013，Nature Genetics）

　　短短几年时间，我国黄瓜基因组研究团队系统性的结合“基因组-转录组-代谢组”，在科学基础研究领域产出了一系列重大学术成果：Nature Genetics（2009，黄瓜基因组研究），Nature（2011，马铃薯基因组研究），Nature Genetics（2013，黄瓜重测序研究），Science（2014，黄瓜苦味合成调控机制），Plant Cell（2015，拷贝数变异决定黄瓜生殖性别），Nature Plants（2016，葫芦科作物苦味性状的趋同驯化与差异进化），这些基础科学研究成果奠基了我国在黄瓜等蔬菜领域基础研究的国际领先水平。

育种应用：基因组结合代谢组解析黄瓜苦味物质的代谢调控与新品种培育

　　2014年11月28日出版的国际顶级学术期刊《Science》以长篇幅论文（Research Article）的形式发表了我国科学家完成的黄瓜苦味合成、调控及驯化分子机制研究。这项研究综合采用了基因组、转录组、分子生物学和代谢组学等多种技术手段，解决了长期影响黄瓜生产的一个重大应用问题。该科研团队，先后开展了黄瓜基因重测序，从1000kg瓜叶中提炼出数毫克的苦味元素（因为普通代谢组检测技术灵敏度低，难以检测到低丰度的次生代谢产物）。通过深入挖掘基因组学数据并结合代谢组学、遗传学、分子生物学等多种研究手段，揭示了9个基因负责苦味物质生物合成的代谢路径，同时发现这9个基因由两个“主开关”基因（Bi和Bt）直接控制，Bi控制叶片苦味，Bt控制果实苦味。在野生黄瓜向栽培黄瓜驯化过程中，Bt基因受到选择，导致无苦味黄瓜的出现。但这个驯化过程并不完全，黄瓜在逆境条件下生长仍然会变苦。

　　进一步研究发现，Bt启动子区域有一个新的突变体--SNP1601，能够使Bt基因在逆境中不表达，可控制黄瓜不会变苦，从而彻底避免苦味对黄瓜品质的影响。黄瓜苦味合成、调控及驯化分子机制的解析，为综合利用苦味物质葫芦素创造了契机。通过控制叶片和果实中的“开关”基因 Bi和 Bt，可培育一个新的“超级黄瓜”品种： 既能利用自身合成的苦味物质进行虫害防御，减少农药使用；又可确保果实中无苦味合成，保障蔬菜商品品质。育种专家们正在利用这个分子育种方案培育新型黄瓜品种。这是蔬菜基因组研究直接用于品种改良的优秀范例（图9）。

图9.培育黄瓜新品种示意图（2014，Science）

药物开发：黄瓜苦味物质开发与人类健康

　　植物中有数以万计的大相对分子质量次生代谢化合物，它们在植物与外界环境相互作用过程中发挥非常重要的作用。其中萜类化合物是中草药中的一类比较重要的化合物，主要包含单萜、倍半萜、二萜和三萜等。黄瓜苦味正是由三萜化合物葫芦素C导致的一类高度氧化的四环三萜化合物，仅在葫芦科植物中（黄瓜、西瓜和甜瓜等 ）被发现（如图10），如西瓜和甜瓜中分别富含葫芦素E和B。

图10. 葫芦科作物苦味性状的趋同驯化与差异进化（2016，Nature Plants）

　　黄瓜苦味物质葫芦素具有很好的药用价值。最早在《本草纲目》中就记载富含葫芦素的甜瓜瓜蒂具有催吐及消炎的功效。现代医学研究发现，甜瓜瓜蒂中含有大量的葫芦素，正是它们发挥了消炎和保肝功效。因此，大量的葫芦素被提取出来并开发成治疗肝病的有效药物。近年来新发现的葫芦素药用价值引起了人们的关注：治疗癌症。葫芦素可通过特异阻断肿瘤细胞生长所需的JAK-STAT信号通路来抑制肝癌、膀胱癌、胰腺癌等癌细胞的扩散，可与其他抗癌药物一块使用，提高癌症治疗的效果。从这个角度来说， “良药苦口”是非常有道理的。

　　虽然野生的葫芦科植物非常苦，但是，苦味素在植物中的含量并不高，要获得足量多的葫芦素进行药物开发和治疗，就必须从植物材料中进行分离和纯化。不论是前期大面积的植物种植，还是后期复杂繁琐的纯化过程，都需要大量的时间和很高的成本。葫芦素属于结构复杂的大分子，利用化学方法进行合成的难度非常大，且面临环境污染的风险。因此，要进一步挖掘葫芦素的药物潜力，必须借助生物合成的方法进行生产，而生物合成的前提是植物中苦味物质合成代谢通路必须清楚。一旦苦味素代谢合成通路构建完成，可以采用类似体外合成青蒿素的技术，将整个葫芦素合成代谢通路导入酵母基因组，通过发酵的方式快速、高效合成和改良葫芦素，为未来开发新的抗癌药物提供了新的思路和借鉴。

图11.黄瓜苦味素合成代谢通路模型（2014，Science）

　　目前，由于现有的非靶向代谢组技术的一些局限性，还无法快速解析不同葫芦科不同物种的苦味素精细合成通路，延缓了后续开展苦味素药物开发的应用。随着广泛靶向代谢组技术的建立，高通量的精确检测代谢物成为了可能，为苦味素的产业化应用提供了新的技术平台。

广泛靶向代谢组：创新的高通量代谢组检测技术

　　广泛靶向代谢组（Widely Targeted Metabolome）：一种整合了非靶向和靶向代谢物检测技术优点的新型代谢组检测技术，实现了高通量、高灵敏、广覆盖的靶向代谢物检测，为高效批量定性、定量检测低丰度代谢物提供了理想的手段（表1）。

　　表1.广泛靶向代谢组技术比较

　　随着广靶靶向代谢组技术（广靶，Widely Targeted Metabolome）的建立，高通量的检测鉴定黄瓜重要代谢通路的物质成为可能，从而避免文中报道的需要从1吨黄瓜中提取微量苦味素，再通过NMR（核磁共振）技术鉴定物质，一方面研究成本较高，周期较长，同时鉴定到的物质种类非常少，属于靶向代谢组检测。目前，迈维代谢提供的广泛靶向代谢组检测技术（广靶）服务，需要提供3-5g鲜样，批量鉴定1000种代谢物以上，使得代谢组检测鉴定物质水平大大提高，成功应用在水稻、玉米、油菜、草莓、甜橙等材料中。

　　在功能基因定位和挖掘研究上，基于广泛靶向代谢组的代谢组全基因组关联分析（Metabolic Genome Wide Association Study，mGWAS），在群体材料中可以批量定位近百个基因，优势远远高于传统GWAS分析（如图12）。形成了基因组研究与表型组研究（生物学功能研究）的有效纽带，相关成果发表在Nature Genetics、Nature Communications、PNAS和Plant Cell等期刊。因此，基于广泛靶向代谢组检测技术，可以有效鉴定和定位葫芦素完整合成代谢通路物质和基因，最终通过发酵的方式快速、高效合成和改良苦味素，为未来开发新的抗癌药物提供了新的方向。

图12.迈维代谢水稻mGWAS（代谢物全基因组关联分析）曼哈顿图（2014，Nature Genetics）

展望：苦味素药物开发与代谢组学研究

　　黄瓜功能基因组学的发展，较为系统的完成了系统生物学的研究范畴，通过基因组、转录组和代谢组的多组学分析，获得了黄瓜庞大的基因组信息资源，解析了黄瓜苦味素物质，为后续应用提供了理论基础。

　　代谢组是基因组的最终产物，是植物体表型性状的直接体现。2015年《Science》杂志提到，What’s Next in'Omics: The Metabolome，代谢组将是下一个关注和快速发展的组学。小编相信，不久将来，广泛靶向代谢组技术将更多的与其他组学结合，解析基因功能和表型性状，包括苦味素合成通路的其他中间代谢物。最终希望通过广泛靶向代谢组技术解析整个苦味素合成代谢通路物质，通过发酵的方式快速、高效合成和改良葫芦素，为未来开发新的抗癌药物提供了新的思路和借鉴，成为我国下一个“青蒿素”。

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　　参考文献：

　　1.A genomic variation map provides insights into the genetic basis of cucumber domestication and diversity. Nature Genetics, 2013.

　　2.Biosynthesis, regulation, and domestication of bitterness in cucumber. Science, 2014.

　　3.Chen W, Wang W, Peng M. et al. Comparative and parallel genome-wide association studies for metabolic and agronomic traits in cereals. Nature Communications, 2016.

　　4.Convergence and divergence of bitterness biosynthesis and regulation in Cucurbitaceae. Nature Plants, 2016.

　　5.Genome sequence and analysis of the tuber crop potato. Nature, 2011.

　　6.Genetic Diversity and Population Structure of Cucumber(Cucumis sativus L.). Plos One.2012.

　　7.The genome of the cucumber, Cucumis sativus L. Nature Genetics, 2009.

　　8.Genome-wide association analyses provide genetic and biochemical insights into natural variation in rice metabolism. Nature Genetics, 2014.

　　9.Genome-Wide Mapping of Structural Variations Reveals a Copy Number Variant That Determines Reproductive Morphology in Cucumber. Plant Cell, 2015.

　　10.Metabolome-based genome-wide association study of maize kernel leads to novel biochemical insights. Nature Communications, 2014.