超越mRNA疫苗？北大开发可应对新冠突变株的环状RNA疫苗

　　2020年初，新冠病毒（SARS-CoV-2）导致的肺炎疫情开始在全球大流行，并一直延续至今。遗憾的是，直到今天，新冠疫情的形势仍然非常严峻。据世界卫生组织（WHO）报告，截至目前全世界范围内超过1.8亿人被感染，累计死亡人数接近400万。

　　值得注意的是，随着新冠病毒在全球范围内的广泛传播，新的变种病毒不断涌现，包括在英国首先发现的B.1.1.7（现在名为Alpha），首先在南非出现的B.1.351（现在名为Beta），首先在南非出现的P.1（现在名为Gamma），以及首先在印度出现的B.1.617（现在名为Delta），这些变种病毒往往具有多重变异，并表现出更强的传染性和逃逸免疫能力。

　　2021年4月23日，印度医学研究理事会（ICMR）的一项研究表明，Delta突变株在S蛋白上具有L452R和E484Q双重突变，并表现出抗体中和反应的下降。

　　这些研究提醒了我们，在新冠病毒不断变异的大背景下，现有疫苗和治疗性抗体或将逐渐降低效果。因此，迫切需要开发安全有效的预防新冠病毒及其突变株感染的疫苗。

　　近日，北京大学魏文胜团队在预印本平台 bioRxiv 上发表题为：Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants（抗SARS-CoV-2和新变种的环状RNA疫苗）的研究论文。

　　该研究报告了一种编码新冠病毒刺突蛋白三聚体受体结合域（RBD）的环状RNA疫苗（circRNA-RBD），circRNA-RBD疫苗可以通过体外转录快速生成，且不需要核苷酸修饰，具有高度稳定性。

　　研究团队通过脂质纳米颗粒（LNP）封装的circRNA-RBD疫苗成功诱导了强有力的持续中和抗体，且该疫苗具有很强的热稳定性，室温下储存2周时间，依然不影响表达。

　　更重要的是，研究团队利用编码RBD变体（K417N-E484K-501Y）的环状RNA疫苗成功在小鼠体内诱导产生有效中和Beta变异株的抗体，表明环状RNA疫苗在抗击新冠变种病毒上具有十分良好的应用前景。

　　21世纪以来，冠状病毒共引起了三次人畜共患疾病，例如2002-2003年的SARS-CoV，2012年的MERS-CoV以及2019年底爆发的SARS-CoV-2。已有的研究表明，冠状病毒通过表面的刺突蛋白（S蛋白）与宿主细胞表面的受体蛋白ACE2结合，从而介导膜融合和病毒入侵。

　　S蛋白含有两个亚基——S1和S2，其中S1亚单位C端的受体结合域（RBD）介导新冠病毒入侵宿主细胞，S2亚单位则介导病毒与宿主细胞膜的融合。新冠病毒的S蛋白、S1亚基或RBD抗原均可以诱导B细胞和T细胞反应，产生抗新冠病毒的高效中和抗体。

　　接种疫苗是结束和预防新冠大流行最有希望的方法。目前已应用的新冠疫苗种类众多，包括灭活疫苗、病毒样颗粒疫苗、病毒载体疫苗以及新兴的mRNA疫苗。

　　新兴的mRNA疫苗，具有生产速度快、成本低，并且能快速应对病毒变异等优点。但与此同时，mRNA疫苗储存和运输条件较为苛刻（－70℃），并具有潜在的免疫原性副作用。

　　在自然界中，环状RNA（circRNA）普遍存在于真菌、植物、昆虫、鱼类和哺乳动物，甚至于某些病毒的基因组本身就是环状RNA，如D型肝炎病毒和植物类病毒。与线性mRNA不同，环状RNA是高度稳定的，因为它的共价闭合环结构可以保护它免受外切酶介导的降解。

　　到目前为止，只有少数内源性的环状RNA被证明可以作为蛋白质翻译模板。虽然环状RNA缺乏翻译成蛋白质所必要的元件，但它可以通过内部核糖体进入位点（IRES）或其5'UTR区域的m6A修饰来实现蛋白质翻译。

　　在这项研究中，研究团队针对新冠病毒及其变种病毒设计了环状RNA疫苗。研究人员利用自我剪接Ⅰ型内含子核酶来产生编码SARS-CoV-2-RBD抗原的环状RNA——circRNA-RBD。为了增强RBD抗原的免疫原性，研究人员将噬菌体T4纤溶蛋白三聚体基序融合到其C端，以此模拟了新冠S蛋白三聚体的自然构象。

circRNA-RBD的设计模式图

　　紧接着，研究团队将纯化后的circRNA-RBD转染到HEK293T细胞中，通过Western blot检测上清液中大量产生新冠病毒的RBD抗原。ELISA定量检测显示RBD蛋白在上清液中达到约143ng/mL，是线性RNA-RBD对照组的50倍。此外，研究人员还进一步证实了circRNA-RBD可以在小鼠NIH3T3细胞中表达。

　　这些结果表明，circRNA-RBD可以在人和小鼠细胞中大量表达新冠病毒的RBD抗原。

相较于线性RNA-RBD，circRNA-RBD的表达量更高

　　不仅如此，研究人员还使用hACE2过表达HEK293细胞和携带EGFP绿色荧光报告基因的新冠假病毒进行结合竞争实验，以验证由circRNA-RBD产生的RBD抗原是否具有功能。他们发现，分泌的SARS-CoV-2 RBD抗原能有效阻断新冠假病毒感染。

circRNA-RBD产生的RBD抗原可以有效阻断新冠假病毒感染

　　在动物实验上，研究团队将脂质纳米颗粒（LNP）包装的circRNA-RBD注射到小鼠体内。研究结果显示，接种了circRNA-RBD疫苗的小鼠的血清可以中和新冠假病毒，且小鼠脾脏中产生了强烈的T细胞免疫应答。

　　这些现象表明，circRNA-RBD疫苗确实在小鼠体内诱导了持久的体液免疫应答和强烈的T细胞免疫应答。

circRNARBD疫苗在小鼠体内诱导了持久的体液免疫应答和强烈的T细胞免疫应答

　　研究团队还设计了针对Beta突变株的circRNA-RBD疫苗——circRNA-RBD-501Y.V2，circRNA-RBD-501Y.V2和circRNA-RBD疫苗，Alpha、Beta和Gamma突变株均有效，其中circRNA-RBD-501Y.V2疫苗对Beta突变株具有更高的中和活性。（该研究进行时，Delta突变株尚未出现）。

　　此外，作者还表示，circRNA还可以用于表达一些其他蛋白质或肽，从而应用于一些罕见疾病或癌症的治疗。

针对突变株的环状RNA疫苗——circRNA-RBD-501Y.V2

　　总而言之，这项研究证实，circRNA疫苗具有热稳定性好、编码抗原表达量高以及适用性广泛等优点，并成功设计了相应的circRNA疫苗来对抗新冠病毒及其突变株的感染，表明circRNA疫苗在COVID-19大流行中可以作为一种全新的疫苗和治疗平台。