蛋白质纯化离子交换法

蛋白质纯化离子交换法：

各种蛋白质分子上可能带有不同的电性，经过离子交换管柱，可依其分子带电性的差异而分离开來 （Pharmacia 操作手册, Ion Exchange）。

    仪器设备：

    塑料管柱 （Bio-Rad Econo-Pac column 732-1010, 1.5×12 cm）

    分划收集器 （fraction collector, 另需准备干净试管约60 支）

    浓缩用离心机 （低速5,000 rpm） 及浓缩离心管Centriplus

    药品试剂：

    DEAE Sephacel （胶体体积约15 mL，预先以缓冲液Buffer A-0 平衡好）

    Buffer A-0 （如上述配法）

    Buffer A-300 溶离液：Buffer A-0 加有0.3 M NaCl

    Buffer A-500 溶离液：Buffer A-0 加有0.5 M NaCl

    方法步骤：

    1） 将Econo-Pac 管柱架好，并将三向阀及软管等组合完成。

    2） 震荡DEAE Sephacel 胶体使的悬浮，小心倒入管柱中，让胶体慢慢沈降，在沈降过程中随时加入buffer A-0，勿使胶体干掉。

    3） 待胶体沈降完全后，高度应在15 cm 左右。胶柱以buffer A-0 一直流洗，流速快慢可以不考虑；连接好收集器，每试管收2.5 mL。离子交换法的胶体平衡极为重要，可测流出液的pH 或离子浓度，看是否与buffer A-0 相同，若不一样则需要再流洗的。

    4） 样本的添加方法同上述胶体过滤法，并启动分划收集器开始收集，当样本全部没入胶体后，再加入同体积buffer A-0。以buffer A-0 流洗50 mL 后，去除胶体上方的缓冲液，但勿使胶体干掉。

    5） 然后依序以buffer A-300, buffer A-500 溶离的，每批次流洗各50 mL，注意更换浓度时，胶体上方勿残存上一种溶液。

    6） 收集所有分划，进行蛋白质定量分析以及GUS 活性测定，结果作图。

    7） 收集GUS 活性区，并以Centriprep-30 浓缩至 _______ mL （IEX），记得要保留100 μL。

    8） 离子交换胶体以buffer A-0 洗过50 mL 后，收起來交回。