第二十八期质谱沙龙活动报道

　　2010年8月14日下午，第二十八期质谱沙龙活动在解放军第二炮兵总医院药学部举行。来自解放军第二炮兵总医院、AB公司、军事医学科学院、空军总医院等20余位专家、技术人员参加了此次沙龙活动。

　　第二十八期质谱沙龙活动现场

　　定量液质应用中常见问题与分析

　　解放军第二炮兵总医院 李鹏飞老师

　　首先李鹏飞老师作了题为《定量液质应用中常见问题与分析》的报告，主要介绍了两方面内容：一是总结了质谱方法建立的基本流程，二是讲解了液质在定量应用中内源性、基质效应和高通量等问题。

　　质谱方法建立的基本流程

　　1、质谱条件优化

　　首先进行储备液配制：最好选用500mL以上的大容量瓶配制，这样准确度更高(可达3个9)

　　用蠕动泵进样来优化：目的是尽量提高待测物的质谱响应信号。

　　主要参数有ESI喷雾电压、电流、DP值、碰撞能量，雾化气辅助气的流速，离子源的温度。其中常优化的是DP值、碰撞能量、雾化气辅助气的流速条件。如果喷针位置可以移动，优化后要记住喷针的位置。

　　根据样品性质确定离子化方式，一般情况下，碱性化合物宜用正离子方式，酸性化合物宜用负离子方式。若化合物结构复杂，可以正、负离子方式都做一下。

　　质谱的分辨率影响信号强度，所以要对低分辨的质谱进行分辨率优化。

　　数据采集速度对峰型影响很大，所以对于多个化合物可以采用分段扫描。有人统计过，一个峰采样点达到12个以上后，峰型才接近正态分布，获得好的定量效果。

　　2、HPLC条件的优化

　　(1)色谱柱选择

　　由于LC-MS分析对色谱分离要求不是很高，所以可以使用短的色谱柱，这样可以节省流动相用量，缩短分析时间，而且使用短色谱柱还能提高灵敏度。流动相中有机相比例尽量高，还可以在流动相中加入一些化合物来提高质谱的信号强度(如甲酸，一些醚类)。针对不同的分析物选择相应的色谱柱。具体选用哪种色谱柱，很好的一个方法是参考色谱柱厂商的资料，可向色谱供应商索取。

　　(2)流动相的选择

　　与传统的HPLC-UV分析有所不同，在HPLC-MS分析中，要求流动相的有机相比例越大越好，出峰时间尽量靠前(在没有基质效应的情况下)。流动相中不能有不可挥发性的盐如磷酸盐，有些在HPLC中使用的扫尾剂如三乙胺和离子对试剂三氟乙酸都会影响质谱的响应信号。

　　根据化合物类型选择流动相组成，常见的有甲醇-水、乙腈-水或甲醇-乙腈-水，某些化合物只有某种流动相体系才出峰。一般正离子方式用甲醇，负离子方式用乙腈好些，通常有机相比例高些好。梯度变化太快对离子化效率影响很大，相应源参数也应该改变，所以恒定比例流动相能满足分离分析要求时尽量不用梯度，尤其定量分析时。

　　流动相中加入甲酸、乙酸铵等可提高正离子化效率，是否加酸不是绝对的，具体应根据LC的分离情况、样品在酸性条件下的稳定性等决定。通常pH低时，[M+H]+比率高;pH值高时，[M+Na]+、[M+K]+或[M+NH4]+比率高，而一般要想信号稳定，能获得较好MS/MS，最好选用[M+H]+或[M+NH4]+。

　　柱后补偿：当不得不用高浓度TFA时，常用异丙醇，解决信号抑制问题，通过柱后衍生化，增加信号的离子化效率。

　　通过调节pH，还可以改变化合物在柱子上的保留时间，一般碱性条件下出峰比较快。

　　(3)流速的影响

　　流速对LC-MS分析有影响，MS属于质量型检测器与流速有关，UV属于浓度型检测器与流速无关。对反相色谱而言，提高有机相比例色谱峰会提前，UV峰面积不变，MS的峰面积会增大很多。提高流速同样也会提高LC-MS的灵敏度。

　　(4)洗脱方式

　　一般采取等梯度洗脱，这样分析速度快，但有时也会采取梯度洗脱。如分析多肽类化合物一般采取梯度洗脱，此时的信号会比等梯度洗脱时强很多，而且可以加大进样量。洗脱方式是提高灵敏度的一种方式，但是分析时间较长，需要有平衡的时间。柱温对色谱行为也有影响。

　　(5)进样量

　　进样量直接影响信号的响应，大进样量可以提高灵敏度，但是受色谱柱载样量的限制，而且对色谱柱及质谱仪的损害较大，所以应当越小越好。溶解样品的溶剂也会直接影响色谱行为，进样体积也会影响峰型，在梯度洗脱时可以加大进样量以提高灵敏度。

　　3、处理样品方法的选择

　　常用的样品前处理方法有：液液萃取，可以起到浓缩待测物的作用;固相萃取SPE，也可以浓缩但成本高;沉淀蛋白(稀释样品)：有机溶剂沉淀法，盐沉淀法，强酸沉淀法，液质一般采用有机酸沉淀法。不常用的前处理方法有反向提取法、衍生化处理等，在一些特殊情况下是可以解决问题的。

　　4、定量分析方法的验证

　　定量分析法一般按照下面的步骤按部就班的做即可：(1)方法专属性，最好不要加内标。(2)标准曲线与线性范围(3)精密度与准确度试验(4)提取回收率和基质效应(5)稳定性试验。

　　定量液质应用中常见问题

　　1、灵敏度

　　首先要用目标离子的子离子碎片定量，因为特征性强，可排除干扰。在定量分析时，尽可能提高每个峰的扫描次数，提高准确率和重复性。可以通过减小扫描质量数的范围来提高目标峰的扫描次数，或将一个样品全部分析时间断分成n个segments，对目标离子单独设置扫描模式。现在的好多新仪器都已有了编程的MRM(如sMRM)，可以在分析成百上千种化合物时自动按上述原则区分，提高了速度，并保证了准确度。

　　一定要通过色谱柱分离后定量分析，避免竞争性离子的存在影响目标离子的离子化效率;如果目标分子未与竞争性分子完全分开，则在离子化过程中导致目标分子的离子化效率降低，导致样品分子的定量结果偏低，当然标准浓度的样品也要用相同的分析方法。

　　2、重现性

　　如果离子源的喷针位置是可移的话，一定要记住做标准曲线时其位置，否则其位置移动后在相同的条件下进入质谱的离子流量会发生改变，标准曲线就不能使用了。所建立的标准曲线一个月后如果想重复使用，则用QC样品检验一下该标准曲线。

　　对于已建立好的分析方法，在扫描范围、流动相的组成、梯度或流速方面不要做任何改动，否则，标准曲线要重作。扫描范围改变目标峰的扫描次数，流动相组成改变离子化效率，流速改变色谱峰的保留时间和峰宽。对于热稳定性不好的样品可移通过提高气速、降低毛细管温度的方法保证定量分析的重复性，一旦方法固定后不要轻易改动。

　　3、多组分同时定量方法(高通量)

　　李老师讲解了他在实验中遇到的一些问题及其解决办法：(1)各组分定量限相差极大，检测限上的限制。如：A浓度远大于B药(100~1000倍)，此时B药检出时，A药高于质谱检测上限;若A药检出时，B药未检出。(2)曲线上的同步问题，A药和B药混合曲线不成线性。(3)单组份质控不合格问题。他是这样去处理的：(1)修改灵敏度高药物的参数，使其响应降低(若定量限相差太大则不适用)。(2)多离子通道时选用非最优离子对。(3)正负离子切换问题同时解决了灵敏度问题。(4)非线性曲线解决了同时定步问题。

　　4、内源性

　　内源性物质是比较难做的，李老师举了一个氢化可的松的例子。他通过做几十个空白溶算平均值得出背景值，然后采用扣背景的方法。

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　　三种新型抗胆碱能药物 立体选择性动力学与代谢研究

军事医学科学院 李敬来老师

　　接下来，来自军事医学科学院毒物药物研究所的李敬来老师，为大家作了题为《三种新型抗胆碱能药物 立体选择性动力学与代谢研究》的报告。李敬来老师，分别从研究背景、研究目的、研究结果三大方面向大家介绍了此项研究的情况。

　　研究背景

　　李老师首先以生动的太极八卦图来形容生物体的手性对应体。生物体本身就是一个手性环境，手性药物进入生物体手性环境中，由于手性环境的作用，手性药物经过吸收、分布、代谢、消除等过程从而产生立体选择性、药理、药效及毒性的差异。

　　李老师介绍了几种手性药物8018、8021、DM8021的拆分、立体选择性药代动力学，并考察了其代谢的差异性。该研究获得了国家“十一五”基金资助。

　　8018是一种I类创新药物，它有两个手性中心，4个手性异构体即R2，S1，R1，S2;其中S2能较强的抑制腺体分泌和具有稳定心率的功效，具有良好的开发前景。8021的消旋体为国家I类新药被批准上市，主要用于抗晕动病。已有研究发现，8021左旋体比消旋体具有更好的抗晕效果，而右旋体无效。DM8021，具有抗帕金森氏综合征的作用，而且进一步药理学机制研究表明其活性异构体为左旋DM8021，右旋体无效。因此DM8021左旋体作为治疗帕金森氏病的新药，具有良好的开发前景。

　　研究目的

　　此项药代研究的目的是建立三种药物手性对映体拆分和定量检测方法(8018的R2、8021的左旋体、DM8021左旋体)及研究其构型转化，继而开展临床前药代动力学研究和手性对映体代谢差异性研究，从而为药效和毒理学提供参考依据，逐步积累手性药物代谢研究经验。

　　研究结果

　　1、手性拆分方法学及构型转化

　　这三种手性药物的拆分，对检测灵敏要求高，必须使用质谱，而质谱与正相色谱都不能够达到分离目的，并且8018又具备难分离的4个异构体，因此给分离带来了困难。在此项研究中，课题组首先探索了光学纯手性衍生化试剂进行对映体衍生化的方法，验证在普通色谱上的拆分情况，效果不佳;继而考查了利用手性色谱柱，通过不断调整分离条件最终实现了分离要求，并通过实验证明了8018、DM8012和8021优映体在动物体内均不发生构型转化，从而为手性药物单一异构体提供了药效作用的手性物质基础，这也是手性药物开发需要研究的关键问题。

　　2、立体选择性药代动力学

　　在实验1的基础上，进而对比格犬分别静脉注射用药及灌胃用药，探究立体选择性药代动力学方法。最终实验结果支持优映体的开发，开发手性药物优映体能增加药物疗效降低毒副作用。

　　3、代谢差异性研究

　　此项实验综合采用了：1)液液提取和固相萃取前处理方法;2)单四极液质全扫描和提取离子筛查代谢产物;3)串联液质联用全扫描和提取离子简单确证单四级液质发现的代谢产物，对代谢产物进行二级碎片扫描，根据原型和代谢产物的特征碎片离子，归属代谢反应位点;4)气质联用作为补充，发现代谢产物，并根据原型和代谢产物EI源裂解的特征碎片离子，归属代谢反应位点。5)提取对映体代谢产物特征离子进行比对，根据代谢产物的保留时间和信号响应强度，研究对映体的代谢产物在质和量上的差异。

　　最终得到以下结论：8018中R2、S1、R1和S2单异构体在大鼠体内均发现6个代谢产物，其中新发现2个产物，3个结构与以往一致，1个与以往结构不同;结合稳定性同位素掺入技术，8012在大鼠体内均发现11个代谢产物，其中4个结构与以往相同，7个为新发现产物;DM8021左旋体和消旋体在大鼠体内均发现10个代谢产物;此外对所有的代谢产物都进行了定量。

　　报告结束后，来自各院所的专家老师进行了激烈的讨论，现场气氛活跃。

液相色谱方法优化中的创新探索：基于“节能减排”的目标导向和“药物色谱数码化”的策略导向

空军总医院 梁贵健老师

　　空军总医院的梁贵健老师给大家做了题为《液相色谱方法优化中的创新探索：基于“节能减排”的目标导向和“药物色谱数码化”的策略导向》的报告，梁老师不是单纯地讲解学术知识，而更多地是在向我们介绍一些新鲜的想法，下面作简要介绍。

　　梁老师先对“就药测药”的现状谈了自己的想法。样品预处理和色谱条件优化研究室色谱技术应用中的两个薄弱环节，主要原因就是“就药测药”，缺乏系统性研究。据梁老师介绍，他已完成的二百多种常用药物的高效液相色谱保留行为规律的研究及其数据库的建立，均来自他们自己实验室的测试数据，在计算机上通过数值拟合和遗传算法，能预测这些药物在不同色谱条件下的保留值。这就是他所谓的“药物色谱数码化”。

　　接下来，结合当下的“节能减排”和“低碳”热点，梁老师从药物HPLC优化方法的三条途径：固定相、流动相和药物性质方面，介绍了一些探索性的思考，启发大家在实验室中来节能减排。

　　最后，梁老师对液相色谱做了一个形象的比喻和简短的总结：大海就像流动相，大地就像固定相，人心就像高压泵，慧眼就像检测器。世外人，法无定法，然后知非法法也;天下事，了犹未了，何妨以不了了之。意思是：大家应在色谱世界更多地去探索，色谱是一个经验的科学，需要大家不拘泥于传统的经验，更多地去创新和探索。

　　本网收录前沿Lab：第二炮兵总医院分析中心