发布时间:2010-11-08 16:24 原文链接: 第二十九期质谱沙龙活动报道

  2010年11月6日下午,第二十九期质谱沙龙活动在北京大学人民医院(北京大学第二临床医院)举行。来自解放军第二炮兵总医院、北京大学人民医院、AB SCIEX公司、天津博纳艾杰尔科技有限公司、北京艾米诺医学研究有限公司等三十余位专家、学者、技术工程师等参加了本次沙龙活动。

第二十九期质谱沙龙活动现场

液相色谱-质谱分析中的基质效应及其解决方案

  北京大学人民医院赵立波博士作了题为《液相色谱-质谱分析中的基质效应及其解决方案》的报告,主要介绍了介绍了液相色谱一质谱(LC—MS)分析中基质效应的产生机制、来源、评定方法和消除措施。

北京大学人民医院 赵立波 博士

  基质效应的产生机制

  LC~MS/MS中的基质效应由分析物的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率所致,表现为离子增强或抑制作用。基质效应由形成带电雾滴时非挥发性的基质组分与分析物离子竞争产生,这些非挥发性基质组分将雾滴牢牢吸在一起,阻止其分裂成更小的微滴。根据接口处离子化和离子蒸发过程中的变化情况,这种竞争可能妨碍(离子抑制)或增强(离子增强)所分析目标物离子的形成效能,亦即分析目标物离子的形成效能与进入电喷雾源的基质密切相关。

  基质效应的来源

  基质效应主要来源于生物样品的内源性组分。内源性组分是指生物样品中存在的有机和无机成分,经前处理后仍存在于提取液中。包括离子颗粒物成分(电解质、盐类)、强极性化合物(酚类、色素)和各种有机化合物(糖类、胺类、尿素、脂类、肽类及其分析目标物的同类物及其代谢物)。其中磷脂是最主要的内源性组分,其对电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)均会产生离子抑制作用,具有表面活性的甘油磷脂酰胆碱是最强的内源性组分 。

  外源性组分在生物样品中不存在,但同样会带来基质效应,其由样品前处理过程引入,包括塑料和聚合物的残留、邻苯二甲酸盐、清洁剂(烷基酚)、离子对试剂、有机酸、缓冲液、SPE柱材料、流动相等。另外,APCI离子化方式比ESI对基质效应更敏感。基质效应不但与离子化方式有关,而且与各个仪器厂家的源设计也有关。

  基质效应的评定

  通过评定基质对分析物信号的影响程度,可大致将基质效应的评定归结为2种方法:柱后注射法和提取后添加法。柱后注射法属于动态方法,注射泵和接色谱柱的液相系统通过三通接头与质谱连接。注射泵恒流注射一定浓度的分析物;生物样品不添加分析物,提取后按已定的色谱条件进样,记录分析物的响应,此方法可考察整个色谱循环的基质影响。提取后添加法是采用提取后添加法建立数学模型评定基质效应在LC—MS/MS中使用的最多,而且,此法可同时考察提取回收率。

  基质效应的消除

  LC—MS分析时的基质效应客观存在,并随生物样品的不同而不同。赵博士介绍了四种基质效应消除的方法——样品前处理、同位素内标、更换离子源和调整流动相,重点讲解了前两种。

   样品前处理

  改进前处理方法、纯化样品、尽可能地减少最终提取液中的基质成分是最有效、彻底地消除基质效应的方法 生物样品的前处理方法很多,研究普遍认为利用有机溶剂蛋白质沉淀法或稀释法处理的样品,其基质效应明显高于SPE或LLE方法。

  通过基质效应评定的方法,可系统检查基质效应产生的环节。例如,尿液中的肌酸酐或木脂素可较强抑制激素类分析,应通过前处理过程去除。在样品进样前进行稀释也可降低其基质效应,但此法在超痕量分析时不适用。尽管样品前处理过程繁琐,但样品纯化仍是最佳的基质效应消除方法

  同位素内标

  同位素内标不但可抵消质谱离子化时的基质效应,还可消除样品前处理过程中的差异。但同位素内标购置困难,且在多个分析物同时检测时,由于存在极性差异,即使是同类物的同位素内标也很难抵消基质效应,造成定量结果偏差:例如,采用原体药物的同位素内标同时分析某药物及其葡萄糖苷结合物,则该内标无法抵消极性较强的葡萄糖苷结合物的质谱离子化变化。


液相色谱梯度方法的开发及其在质谱定量技术中的应用

  解放军第二炮兵总医院李鹏飞老师作了题为《液相色谱梯度方法的开发及其在质谱定量技术中的应用》的报告,主要介绍了梯度洗脱的特点、方式、步骤和开发。

解放军第二炮兵总医院 李鹏飞 老师

  梯度洗脱基本知识

  梯度性地改变洗脱液的组分(成分、离子强度等)或pH,以期将层析柱上不同的组分洗脱出来的方法,在同一个分析周期中,按一定程度不断改变流动相的浓度配比,称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。

  梯度洗脱的优点是:单位时间的分离能力增加,检测灵敏度提高,使样品与溶剂前沿基线分离,降低基质干扰;缺点是:仪器设备要求高,不适合某些检测方式,柱需再生-增加分析时间,基线漂移。提高柱效改善检测器的灵敏度当样品中的一个峰的k'值和最后一个峰的k'值相差几十倍至几百倍时,使用梯度洗脱效果特别好。梯度洗脱中为保证流速的稳定,必须使用恒流泵,否则难获重复结果。梯度洗脱常用一个弱极性的溶剂A和一个强极性的溶剂B。

  梯度洗脱步骤

  梯度洗脱的一般步骤是:1)选择两种合适的溶剂A和B。2)进行初步分离。3)在接近tO处如果谱带挤在一起,则应降低初始溶剂A的强度,若谱带远离色谱图的开始部分,则应增大A的强度;如果需要洗脱很长时间,则应增加溶剂B的强度;如果所有的谱带都在比较靠前的位置被洗脱,则应降低B的强度。4)如有必要可以调节斜率;为增大灵敏度可以增加斜率,为增大分离度,可以降低斜率。5)必要时为提高选择性可改变溶剂B。6)解决具体问题,比如溶剂分层,没有有效的弱溶剂A时,可以用梯度延迟来解决谱图前部分分离不良的问题。

  梯度洗脱平衡时间大于8~9分钟,平衡即充足,有机污染物影响梯度分析,如“三蒸水”有大量有机污染物不适合做梯度分析。

  梯度方法开发实例

  第一步,开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法,用C18柱,在最初的条件下(0-100%,水-乙腈),分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长,分离度叶不好。

  第二步,为使色谱峰前移,提高起始时乙腈的比例(50-100%,水-乙腈),分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰,说明有杂质存在,很可能是流动相水中的。

  第三步,从空白梯度图显示,在同样的色谱条件,同样的检测灵敏度下,共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。

  第四步,空白梯度图同样品的色谱图进行对照后,我们看到杂质(共两个峰)中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰,会使其定量分析结果不准确。

  第五步,根据“梯度曲线下的面积越大,洗脱能力越强”的规律,试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5,50-100%B),但是小峰仍没有分出来。

  第六步, 根据“梯度曲线下的面积越大,洗脱能力越强”的规律,试用#5曲线使3-9号峰提前,改用50-95%B见到好的现象。

  第七步,最后用50-95%B,得到好的结果。

  梯度方法开发首先要明确目标,如整个色谱峰组保留时间太长,分离度也不好,杂质分离等;然后对症下药,如为使色谱峰前移,提高起始乙腈的比例,分离得到改善。

  最后,李老师又介绍了其它几种梯度形式并用赵老师的话总结了选择梯度的原因:不管是作单一的还是多个化合物的分析,液质联用尽量用梯度洗脱,以来可以使质谱峰形更窄,灵敏度更高;更重要的是可以降低成本,比如对一根新色谱柱,走等度可走1000针,而梯度可以到2000针;梯度方法里,柱子被清洗得更干净。

,

Triple TOF 5600 在生物标志物发现中的应用

  郭立海博士作了题为《Triple TOF 5600 在生物标志物发现中的应用》的报告,主要介绍了蛋白质组发展趋势及其对质谱技术的要求,Triple TOF 5600分析蛋白质的三种应用,Triple TOF 5600独特的设计支持了同时定性定量等内容。

AB SCIEX公司 郭立海 博士

  蛋白质组发展趋势及其对质谱技术的要求

  郭博士首先描述了蛋白质组概念,并和基因组作了简单比较。接着郭博士对发现、靶向蛋白质组和定性、定量蛋白质组的概念进行了形象地解释并从中阐述了蛋白质组的发展趋势。

  发现蛋白质组(Discovery Proteomics)类似于撒网捕鱼策略,优点是快速、大规模、高通量,能得到大量数据和信息;缺点是数据太多,数据后期处理比较麻烦,大量的数据中有意义的数据少,不一定能得到直接感兴趣的数据。这是传统蛋白质组学。靶向蛋白质组(Targeted Proteomics)的靶向性和目的性都很强,类似于采用特异性强的诱饵,有目的性的同时在多个区域大规模放置钓竿,钓得研究者真正感兴趣的、最有研究潜力的鱼,撇开其它的干扰,从而加速针对性强的研究。这是最近两年才兴起的新的蛋白质组学方向。

  定性蛋白质组(Qualitative Proteomics)就是解析蛋白质的一级结构信息,包括这个蛋白质的氨基酸序列是什么,发生了怎样的结构变化或翻译后修饰等,比如蛋白质表达谱、修饰谱等。定性蛋白质组是蛋白质组研究的基础,起步的蛋白质组主要是鉴定生物样品里都含有什么蛋白质,现在依然很重要,因为生物体里还有大量的蛋白质并未被鉴定,大量的修饰信息还未被覆盖。定量蛋白质组(Quantitative Proteomics),靶除了知道是什么蛋白或发生了怎样的修饰外,还要给出量的信息,这是后蛋白质组时代的要求。因为蛋白质组是动态的,研究在某种特定条件下蛋白质量的变化才有可能揭示真正的生物学问题,况且生物标志物本身就是靠定量来发现的,这是现在蛋白质组研究的重中之重。尤其是近几年来各种同位素标记方法(iTRAQ试剂)和串联四极杆特定的定量方法-MRM应用在蛋白质研究中,更是推动了定量蛋白质组的蓬勃发展。

  定性、定量蛋白质组研究对质谱技术提出了很高的要求,定性方面要求质谱仪器灵敏度高、速度快、准确度和分辨率高;定量方面首先要求定性,同时要定量动态范围宽、 定量准确度高、稳定性和选择性好。AB SCIEX公司推出的Triple TOF 5600可以实现漂亮的定性,同时兼做定量。高分辨率、高质量准确度、高灵敏度、高采集度和高定量线性动态范围,在MS和MS/MS,在定性和定量,总是同时达到。

  Triple TOF 5600分析蛋白质的三种应用

  接下来,郭博士重点讲述了Triple TOF 5600 在蛋白质组分析方面三种应用模式(技术路线)。

  IDA定性

  IDA是纯定性的,目的是鉴定更多的蛋白质。IDA工作模式是先进行色谱分离,然后进行质谱扫描,一级扫描结束后要快速进行二级扫描,这样才能鉴定出更多的蛋白质。同时,一级扫描和二级扫描全部是高分辨的,能把更多的峰区别开来,从而鉴别蛋白质的数量也就增多。接着,郭博士举了酵母细胞裂解物实验以及大肠杆菌和植物蛋白等检测的例子,均证实Triple TOF 5600表现出很好的效果。

  定性定量,label free

  定性定量兼做实际上是做蛋白质组的时候做非标记定量。比如说两组蛋白——一组是疾病样,一组是正常的,然后进样比较鉴定蛋白质,根据峰面积看哪些蛋白质发生了变化。它的工作模式也是先进行色谱分离,然后进行一级扫描,一级峰面积是用来定量的,可以计算肽的相对量是多少。一级扫描速度要慢,从而得到更多的数据点,同时分辨率也会更好一点。因为是高分辨率,所以提取峰的窗口可以缩到很小,达到消除干扰,提高特异性的目的。随后有很多的二级扫描,速度比较快,这主要是来定性的。接着,郭博士举了人体蛋白酶酸化肽的例子。

  高分辨MSMS定量(MRMHR)

  高分辨MSMS定量与MRM有所不同,它在方法中要指定母离子,消除背景干扰,定量更准确,而没有指定碎片离子。打入几十或几百个母离子去扫描,就能得到所有母离子碎片,相当于不做一级扫描,直接进行母离子碎片二级扫描。由于扫描速度快,能够对所有母离子碎片进行全扫描,而不是特异扫描,然后从中截取三个较好的响应值叠加到一起,消除定量差异性。高分辨对定量的好处是能够进一步缩小截取的窗口,消除干扰,提高选择性。接着,郭博士举了一个血浆样品中蛋白质分析的例子。

  Triple TOF 5600独特的设计支持了同时定性定量

  Triple TOF 5600是第一台集高准确质量数、高分辨、高扫描速率和高定量灵敏度为一体的系统,一次进样就可完成复杂样品中低含量化合物的定性确认和定量分析,能非常方便地从定性工作流程(如定性确认、筛查)转化为定量分析。那么,Triple TOF 5600到底有哪些独特的设计,同时实现了定性定量?

AB SCIEX Triple TOF™ 5600

  AB SCIEX Triple TOF™ 5600系统特点为:

  • 高灵敏度,在全扫描和二级质谱扫描方式,灵敏度达到业界高端QQQ质谱的MRM水平;
  • SmartSpeed™ 100Hz采集速率,每秒可完成100次MS/MS 或MS扫描;
  • 高分辨率,在任意扫描速度下质谱分辨率都可达到40000;在低质量端m/z 100左右,也可达到30,000以上的分辨率;
  • EasyMass™ 准确度,质量准确度小于1ppm(RMS);
  • 线性动态范围,可达5个数量级;
  • 系统非常可靠,用外标法,质量误差长期可以保持在~1ppm。

  与仪器配合使用的还有用于快速简便地处理/显示大量质谱数据的峰观测(PeakView™)软件,用于简化小分子和大分子定量流程的多组分定量(MultiQuant™)软件,用于简化蛋白质组学研究的蛋白导航(ProteinPilot™)软件等。AB SCIEX Triple TOF™ 5600系统在高级飞行管、光学聚焦技术、真空系统等硬件方面也有重大改进。TripleTOF 5600系统为生命科学家在复杂样品的全面分析、快速筛选和高分辨定量等方面提供了强大的、新的工作流程,这些性能是在其它类型的质谱中不可能获得的。

  本网收录:TripleTOF™ 5600质谱系统


血浆样品的快速处理方法

  天津博纳艾杰尔科技有限公司韩勇技术工程师作了题为《血浆样品的快速处理方法》的报告,主要介绍了天津博纳艾杰尔科技最新的三款产品——蛋白沉淀板、SLE和MAS及其应用和各方法比较。

天津博纳艾杰尔科技有限公司 韩勇 技术工程师

  蛋白沉淀板

  传统的蛋白沉淀法的缺点:繁杂的加样、涡旋、离心、转移等操作,可能造成药物损失;不是一种高通量的方法;不适用于自动化的仪器。Cleanert蛋白沉淀产品有两种产品形式。在方法开发时可以使用柱形管式,在处理实际样品时可以使用96孔板形式。疏水性筛板具有阻挡以水为主要成分血浆的下渗,阻挡变性蛋白,乙腈、甲醇等有机试剂易于通过等性质。蛋白沉淀板的优点是:获得更洁净的样品,操作简便快速、减少样品损失,是一种高通量的样品处理方法,与自动化萃取仪器兼容,传统蛋白沉淀方法的简单移植。

  SLE

  液液萃取法的缺点:繁杂的加样、涡旋、离心、转移等操作,可能造成药物损失;产生乳化现象;不是一种高通量的方法;不适用于自动化的仪器。SLE采用特殊工艺处理的硅藻土为填料,此填料具有较大的比表面积和较低的表面活性,能够提供一个理想的液液分配的支撑表面。SLE 的操作方法:血浆样品上样,样品在硅藻土表面形成一层薄薄的液膜;静置5分钟;加入适量的洗脱溶剂洗脱,重力洗脱,洗脱溶剂包裹在样品层外部,两液膜间进行微观的液液萃取。SLE的优点是简便快速、是一种高通量的样品处理方法,避免液液萃取容易产生的乳化现象,与自动化萃取仪器兼容,液液萃取方法的移植。

  MAS

  固相萃取法的缺点:方法建立较为复杂,为了获得良好的回收率和净化效果,常常需要调节上样的pH值以及淋洗液和洗脱液的强度;操作仍较为复杂、耗时;对极性较强的药物效果不好。MAS(Multi-function Impurity Adsorption SPE),即“多重机制杂质吸附萃取净化法”,该方法主要利用多官能化的复合吸附材料,以离子交换、反相、氢键等机理去除生物样品中的主要内源性干扰物质,同时将目标药物留在样品溶液中,从而达到净化的目的。疏水性的筛板可以阻挡以水为主的血浆和变形的蛋白,而乙腈等有机试剂易于通过,填料吸附杂质而不吸附药物。MAS的操作方法:乙腈活化,负压或正压抽干;血浆样品上样;快速加入乙腈洗脱,同步完成蛋白沉淀与药物提取;加正压或负压,收集洗脱液,进行后处理或直接检测。MAS的优点是:操作简便、快速、是一种高通量的前处理方法,较好的除磷脂效果,极好的平行性,适用于强极性药物,与自动化萃取仪器兼容。

  最后,韩工介绍了血浆中氢氯噻嗪蛋白沉淀方法的建立,血浆中托特罗定SLE方法的建立,血浆中托特罗定MAS方法的建立;血浆中普萘洛尔MAS方法与蛋白沉淀法的比较,血浆中地塞米松蛋白沉淀法、SLE法和MAS法检测结果比较等。

相关文章

莱伯泰科重磅发布三重四极杆质谱,持续进军半导体行业

北京莱伯泰科仪器股份有限公司(股票代码:688056.SH,以下简称“莱伯泰科”)在自主研发创新领域再获重大突破。3月10日,“致知力行踵事增华--莱伯泰科半导体行业三重四极杆质谱新品发布会”在莱伯泰......

这台沃特世UPLC质谱中标山东大学氢氘交换质谱采购

近日,山东大学氢氘交换质谱采购项目的中标结果公布,中标的质谱产品是沃特世的AcquityUPLCM-Class/HDX氢氘交换质谱,中标金额近227万元。一、项目编号:SDJDHF20220571-Z......

国家重点研发计划重点专项“单细胞质谱分析仪”项目启动

2月26日,由中国计量科学研究院(以下简称“中国计量院”)牵头承担的国家重点研发计划“基础科研条件与重大科学仪器设备研发”重点专项“单细胞质谱分析仪”实施方案论证暨启动会在中国计量院昌平院区召开。科技......

346万元!郑州大学采购液相质谱联用仪和微孔板检测仪

近日,郑州大学化学学院发布《郑州大学化学学院液相高分辨质谱联用仪和多模式微孔板检测仪及配件采购项目》通知,花费346万元采购液相高分辨质谱联用仪和多模式微孔板检测仪及配件。详情信息如下:一、合同编号:......

使用HRMAM对NIST单抗的关键质量属性进行监控

随着治疗性生物产品在全球药物市场所占份额的不断提高,各国监管机构通过发布质量源于设计(QualitybyDesign,QbD)原则等手段,对生物药的质量控制提出了更高的要求。对于生物制药企业而言,在生......

HILICMSVSIPRPLCMS:在DNA引物小核酸和mRNA加帽率分析应用

核酸是蛋白之外,生物制品领域另一重要分支。近年来,核酸药物引起了公众和研究单位极大的兴趣。本文就DNA核酸引物、小核酸和mRNA加帽的色谱质谱方法进行讨论。DNA引物是PCR测序的起始原料,其质量的优......

​2023年杭州市重点项目名单:2个质谱基地、19个医药项目

近日,杭州市发布《2023年杭州市重点实施项目名单》。共742个项目,其中有两个质谱试验基地:“泽天春来科技高端光谱-质谱仪器创新制造基地”、“谱育科技青山湖科技城高性能四极杆联用质谱仪产业化项目”;......

SCIEX质谱沙龙—青岛站活动在立菲医疗器械创新园成功举办

2月22日,SCIEX质谱沙龙—青岛站在立菲医疗器械创新园成功举办,本次沙龙活动有幸邀请到中国科学院海洋研究所中心实验室主任,中国分析测试协会理事,山东省理化分析测试协会副理事长,青岛市分析测试学会副......

艾捷博雅:突破质谱前处理自动化瓶颈的分离纯化引导者

“玩了一辈子沙子”,这是艾捷博雅生物集团董事长汪群杰对自己的描述。从研究生、博士到博士后,汪群杰一直在做有机硅材料,入职安捷伦后开始接触色谱分离材料,在以硅材料为核心的分离材料上有深厚的沉淀。从安捷伦......

“高分辨率二次离子质谱仪研制”项目启动会召开

近日,由中科院海洋研究所牵头承担的国家重点研发计划“基础科研条件与重大科学仪器设备研发”重点专项“高分辨率二次离子质谱仪研制”项目启动暨实施方案论证会在青岛召开。会议现场 中科院海洋研究所供......