发布时间:2019-07-11 16:26 原文链接: dPCR推动精准医疗迅速发展

  数字PCR简介

  数字PCR(Digtal PCR)是一种核酸定量精密检测的新兴技术手段,于20世纪由Vogelstein等提出。它是将稀释后的核酸模板分配到大量不同的反应单元中,使每个反应单元中有一个或没有核酸。利用PCR扩增的同时,加入可检测荧光。待扩增结束时,使用统计学方法采集每个反应单元出现的荧光次数,从而定量检测样本中的核酸浓度。

  基于分液方式的不同,数字PCR主要分为3种:微流体数字PCR(Microfluidic digital PCR,mdPCR)、微滴数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)和芯片数字PCR(Chip digital PCR,cdPCR)。

  数字PCR的优势

  相对于二代测序、基因芯片和定量PCR而言,数字PCR具备以下优势:

  · 灵敏度可达到单个核酸分子:检测限低至0.001%,主要系为数字PCR可以实现靶标DNA/RNA的生物浓缩;

  · 无需标准曲线活参照基因进行对比来测定核算量,可对靶分子起始量进行绝对定量,直接独处DNA分子的个数;

  · 适合环境复杂样品的检测:终点PCR检测,不依赖Ct值,不依赖扩增效率,能克服PCR抑制剂的影响,避免样品间的交叉感染问题,适合各类复杂环境中的样本进行绝对定量,如动血样、粪便、尿液、痰液、水样、土壤、植物等;

  · 能够有效区分浓度差异微小的样品:更好的准确度、精密度和重复性,可以用于精确测定靶基因的相对表达,基因拷贝数变异分析等。

  · 数字PCR可开发针对不同癌症、不同样本以及不同的样本环境提供检测解决方案,该技术的应用范围广泛,尤其在液体活检领域,已开发针对肺癌、乳腺癌、肠癌、胃癌等上百个位点检测试剂盒,可精准指导临床治疗的诊断,以便患者在后续得到更及时并且适当的治疗方案提供。

  数字PCR技术应用

  随着美国FDA批准了一款用于白血病BCR-ABL融合基因检测的数字PCR试剂盒,标志了这一技术正式走向广阔的临床应用市场。我国的分子诊断市场正处于快速发展阶段,预计2021年可以达到100亿以上的规模,而数字PCR将成为这一市场高速增长的重要驱动力。

  数字PCR技术可广泛应用于肿瘤液体活检、靶向治疗伴随诊断、无创产前检测、病原微生物(病毒、细菌、真菌等)检测、食品安全检测、遗传疾病诊断、移植排斥监控、肠道菌群分析、药物基因组检测、基因表达分析、环境检测和分子生态、农业和动植物检测等多个研究方向。以下简要介绍其中几种。

  1. 肿瘤的早期研究

  循环肿瘤DNA(ctDNA)是活肿瘤细胞释放的DNA,半衰期约为1.5h。对循环肿瘤DNA进行及时监测分析,不仅有利于早期发现癌症,还能监测癌症复发情况,这对癌症患者的发病率和死亡率产生重大影响。与肿瘤组织活检相比,血液循环肿瘤DNA分析具有微创性,可以定期随访癌症患者监测癌症。然而,使用ctDNA进行早期癌症诊断也并不容易,因为血液中存在的肿瘤DNA的量较少,并且肿瘤DNA会被源自非肿瘤细胞的DNA稀释。基于液滴的数字PCR等新技术的开发大大提高了检测稀有序列的灵敏度、特异性和精确度,为癌症的早期研究和诊断奠定基础。

  2. 肿瘤治疗的伴随诊断

  常用体液来源(如血液,胸腹水,唾液及尿液等)的待检标本中的DNA,有正常脱落体细胞和病变脱落细胞两种来源,前者的量远大于后者。通过微液滴处理能在每个微液滴中有效减少正常体细胞DNA的干扰,实现肿瘤标记物的有效检测,如EGFR,ALK,ROS1,KRAS、BRAF等基因的突变检测、乳腺癌/胃癌的HER2基因扩增检测等,应用于肿瘤精准医学的伴随诊断。

  3.无创产前筛查

  现有的遗传学产前诊断方法大都需要通过羊膜穿刺、绒毛取样等侵入性技术从母体子宫内得到胎儿样本(细胞、排泄物等) 再进行遗传学分析。经过几十年的发展与完善,无论是准确度和安全性都已经得到医学界的公认,但仍存在一定程度的胎儿流产和死胎的可能性。

  基于母体血液分析的无创产前遗传疾病筛查是如今的研究热潮。如21号染色体为3倍体的唐氏综合征、已知父母基因型的胎儿地贫检测或已知父母基因型的其它核酸病检测(孟德尔相关遗传疾病)。由于目前标本来源主要为血液,而待检测的胎儿DNA受到母体DNA的干扰,因此检测的准确性受到影响。基于独特的微滴化数字PCR技术,可作为二代测序法的补充进行无创产前诊断,从而提高准确度及分辨率。因此,数字PCR技术在遗传学产前检查中具有广泛的应用前景。

  4.病原微生物的检测

  疾病预防控制中心、出入境检验检疫局系统的实验室,采用数字PCR技术了可满足该类实验室对于检测结果的要求:灵敏度更高、重复性更好、无需依赖标准曲线的绝对定量结果,同时操作简便。

  对于研究类型的实验室,可利用dPCR灵敏度高的特点,对各种样品中的病原微生物进行研究。如HIV抗逆转录病毒治疗过程中病毒残留量的监控;HBV耐药突变的检测;HCV的分子分型;抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的院内感染监控;环境微生物不同功能基因之间的连锁分析等。

  5. 甲基化含量鉴定

  作为表观遗传学研究中重要的一个研究方向——甲基化程度分析,现阶段有不同的方法或技术来进行研究:如传统的亚硫酸氢盐处理后的克隆测序统计法、抗体检测法、定量PCR检测法等。这些方法皆因方法学的问题而不能获得精确的定量,而微滴式数字PCR系统通过对样品的微滴化处理及目标因子的绝对拷贝数定量,为甲基化程度的精确定量检测提供了一种全新的技术。

  6.拷贝数分析

  基因拷贝数变异(Copy number variations,CNVs)是指人类基因组中存在的,较之于参照基因组DNA片段缺失或复制大于1kb到Mb的亚微观结构变异,CNVs本身蕴含着丰富的遗传信息,对于研究基因变异在生物进化及疾病进程等领域具有重要意义。相较于现有的CNVs研究技术(定量PCR、高密度寡核苷酸芯片high density oligo nucleotide array,FISH,比较基因组芯片microarray based comparative genomic hybridization,array-CGH,测序等),dPCR在灵敏度和分辨率方面更具优势,尤其适用于更高拷贝数分析,确定确切的拷贝数,检测精度超过±10%。

  数字PCR技术领跑者

  国际上,ABI(Applied Biosystems)和Bio-Rad是数字PCR仪器领域的两大巨头。

  · ABI(Applied Biosystems):ABI的dPCR仪器为QuantStudio 3D,采用芯片式分液技术,操作流程全自动;

  · Bio-Rad:Bio-Rad的dPCR仪器包括QX200和RainDrop,均采用液体式分液技术,操作流程均半自动。在价格上,RainDrop优于QX200和QuantStudio3D。

  另外,基因行业巨头例如Illumina、Roche(罗氏)、ThermoFisher(赛默飞)、Qiagen(凯杰)等均已布局数字PCR技术领域,极大地推动了该领域的产业化进程。

  国内企业包括泛生子、永诺生物、科维思、诺禾致源、小海龟科技、领航基因、新羿生物、爱普拜、锐讯生物均已进军数字PCR技术领域。(对于布局数字PCR技术的公司,如有遗漏,欢迎大家在评论区进行补充哦。)

  总而言之,数字PCR技术自问世以来,在遗传病、病原体、癌基因检测等分子诊断领域等领域发挥了不可替代的作用。可以预见,它将继续引领分子诊断热潮,推动精准医疗的发展。

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