elisa试剂盒实验中的注意事情

异常

结果描述

原因分析

对策

白板

显色步骤结束后，酶标板所有孔均无颜色。阳性对照不显色。

试剂已过效期，或不同试剂盒组分混用

检查试剂的组分及批号，确认未过期以及所有组分均属对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。

错加、漏加试剂底物、显色剂A或B

严格按说明书的步骤操作，加完试剂后可观察一下液面高度是否一致，以减少漏加现象。

洗板及加样过程中，酶标受污染失活失去催化显色剂显色的能力

确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净。

终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配制

每次配制时都应看清标签标明物质。

蒸馏水有问题

确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染，与好蒸馏水比较。

显色弱、灵敏度低

实验结束后，包括阳性对照、质控在内的所有板孔颜色均较淡。

试剂盒超过期，超过有效期的产品可能会产生很弱的信号；试剂盒没有按规定进行保存，受高温影响；

实验前检查试剂的组分及批号，确认试剂未过期。不要将试剂盒长时间置于常温下，按使用规定储藏。

试剂、样品用前未平衡至室温

从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平衡20分钟左右。

加入试剂的体积和时间有误，移液器计量不准，吸嘴内水分太多或不清洁；

确定所使用的试剂体积正确，加入时间适当。校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快，排放应完全。

洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力；

确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净，确认配制洗液的纯化水达到要求且未受污染。

孵育时间及孵育温度未达到要求，反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。

孵育温度应控制在37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。保温期内不宜多开门，以免影响保温。

洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求；洗涤冲击力太大。浸泡时间太长；

严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板，减小洗涤冲击力，按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数。

显色剂加量不足或顺序颠倒，或混合后加入；

显色剂滴瓶垂直向下，持力均匀，滴速不宜过快，先加显色剂A，后加显色剂B，不可将A、B液混合后加入。

底物作用时间不够；

准确定时。

蒸馏水水质有问题；

测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响。

实验结束后，阴阳性对照正常，质控正常，但临床标本感觉显色较弱

待测标本中可能不含强阳性标本，故结果可能是正常的

如有怀疑，可复检

标本加入叠氮钠作为防腐剂

酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用proclin、硫柳汞等其他防腐剂

阴阳性对照正常，但质控、参考品或个别弱阳性标本未能检出。

未达要求的孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本，但质控或弱阳性标本受温度变化影响较大而被未检出。

确认孵育的温度及孵育时间达到要求。

质控品或标本高温放置过久，或被反复冻融致待测物滴度下降，而未能检出

质控品或标本避免反复冻融。标本在一周内使用的，可存于2-8℃，如需长期保存，应置于-20℃以下保存。质控品应小量分装，并置于-20℃以下保存。

仪器设定不正确，滤光片不匹配。

重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。

终止后，目测结果正常，但酶标仪读值结果偏低

酶标仪参数设定不正确。

重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。

灵敏度过高、板底高、高背景

终止后，整板结果显现均一的黄色或淡黄色；或阴阳性对照、质控正常，标本阴性标本OD值过高。

整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成，如同时操作两对半试剂时，测HbsAb板用于测HBsAg等；

实验前检查试剂的组分及批号，确认所有组分均属于对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。

酶标对吸头的污染以及对盛放显色剂容器的污染都易造成黄板现象；

避免试剂组分间的交叉污染，确保吸头、容器的干净。

显色剂在光照条件下放置过久，实验前已变蓝

显色剂A、B未使用前避光保存

孵育温度过高或孵育时间过长；

孵育温度应控制在37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。

未按要求洗板。特别是洗涤时每孔未注满洗液，易造成花板黄板现象

严格按说明书要求洗板。

花板，一般是由于临床标本的收集、处理和保存方法不当造成

放置时间（自然放置1~2h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意。

出现随机性的花板、跳孔现象

样品离心不完全，反应孔内发生凝血或残留细胞成分；

充分离心，3000rpm6分钟以上。

加样时交叉污染；

加标本时尽量避免交叉污染。如盛标本的试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板。

手工洗板造成的交叉污染

手工洗板时前3次注洗液后应立即弃去，后几次再设定浸泡时间，可减少交叉污染

洗板机加液头堵塞导致加液不满或吸液残留量较大，造成花板、跳孔

疏通加液头，使洗板时每孔均注满洗液，吸液时残留量要小。

拍板时交叉污染

洗板完毕拍板时用合适的吸水纸巾，不要把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍，以免交叉污染。

假阳性

假阳性现象是一个综合现象，可参考上文“灵敏度过高、板底高、高背景"中的分析。这里只列举常见的原因及对策。

计算Cutoff值时使用的公式不正确，导致计算得出的CutOff值过低，从而导致出现假阳性

CutOff值计算公式应严格参照所属产品的说明书，应注意各个酶免产品的Cutoff值计算公式不尽相同。

洗板时未能注满洗液或洗板次数、浸泡时间不够，洗涤不充分，样品中有其他成分残留导致花板、跳孔，假阳性增多

严格按说明书要求洗板。调整洗板机时，应注意有时仪器标示的液量与实际液量并不相符，应根据实际情况调整至每孔注满。

血清标本处理不当，如未除去细胞成分、纤维蛋白原及其它干扰物可出现孔底由变蓝的跳孔现象，此标本重复实验结果往往是阴性；

放置时间（自然放置1~2h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意。

厂家试剂质量的变化造成；

国家标准要求提高灵敏度时，厂家试剂灵敏度也相应提高，假阳率常常有所上升，但只要在合理范围，是可以接受的。

水质问题；

防止蒸馏水污染。

加酶量过多（如50uL误认为100uL）或丙肝酶稀释时加量过多；

加酶前检查移液器调节量是否准确，稀释酶时思想要集中。

培养箱温度超过37℃或酶结合物反应时间或底物显色时间超过；

放入板以前要检查培养箱的温度，准确定时。

底物配制时间过长、或底物污染；

底物应在酶反应完毕即将洗涤前5分钟配制，注意避光。

该批样品放置时间过长，样品污染；

样品应保持新鲜，或低温保存，防止污染。

移液嘴重复使用，未洗净或消毒不完全而用于加酶或底物；

移液嘴尽可能一次性使用。

重复性差

1、样品数量不一，加样时间长短不一；

重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近。

2、样品加入后未混匀；

加样后在混匀器上充分混匀。

3、酶标仪滤光片不对或输入波长不对；

TMB显色用450/630波长.

4、酶标仪测定重复性差；

校对酶标仪。

5、洗涤不正确；

洗涤液注满各孔但不要溢出。洗板时反应板面向下，垂直用力甩净内容物（可多甩几次），在干净、无或少尘的吸水材料上拍干。洗板机洗板时不应有堵孔，洗涤应充分。

6、温育条件不一致（一次用水育，一次用恒温箱）

恒温箱温育较水浴显色深，OD值高出0.1-0.15,最好均采用恒温箱.如用水浴水温应控制在37℃。

7、不慎多加或少加酶或显色剂；

多加时显色深，少加则浅，用记号笔圈上，便于分析。

8、阈值附近时阴时阳；

同一样品做三个复孔，以二个（含二个以上相同结果为准）

9、加样量不足、保温时间、洗涤条件一致；

尽可能使用同一移液器和装紧吸嘴重复测定标本。条件、人员等应尽量与上次保持一致。