hERG钾离子通道高通量安全性筛选（二）

材料和方法

稳定转染人Kv11.1 通道的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)来自ChanTest 公司(Cleveland, OH)。本实验中所使用的所有试剂和药品均来自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO).

hERG 离子通道多次加样方法的开发

多次加样的方法中细胞需要进行多次的溶液交换并且电压刺激时间延长，从而增加了电流rundown 的可能性。为提高试验时间加长后细胞记录的稳定性，使用单次脉冲电压刺激方案代替原来单次加样方法中的５次脉冲电压刺激方案。化合物溶于细胞外液中，浓度为3 倍终浓度，含有1% DMSO。

实验时加入记录孔后被稀释至最终浓度，DMSO 的浓度为0.33% 。化合物加入记录孔后孵育一分钟后开始给予电压刺激，+40 mV 持续一秒，然后再施加-50 mV 刺激一秒，用以检测尾电流峰值（图1）。一次实验需要准备6 个不同浓度梯度的化合物板，便于加样头完成6 次加样。完整的实验方法确认后，依次检测选定的7 个hERG 阳性药物。

化合物溶于细胞外液中，浓度为3 倍终浓度，含有1% DMSO。实验时加入记录孔后被稀释至最终浓度，DMSO 的浓度为0.33% 。化合物加入记录孔后孵育一分钟后开始给予电压刺激，+40 mV 持续一秒，然后再施加-50 mV 刺激一秒，用以检测尾电流峰值（图1）。一次实验需要准备6 个不同浓度梯度的化合物板，便于加样头完成6 次加样。完整的实验方法确认后，依次检测选定的7 个hERG 阳性药物。

多次加样实验的记录稳定性结果见图2。图中分别展示了其中一次实验所有384 孔的平均封接电阻值，以及24 个
对照孔0.33% DMSO 外液6 次加样后得到的尾电流峰值为基准的平均通道激活程度。

单孔多次加样方法的药理学特性：产生的累积浓度效应数据类似于传统膜片钳技术方法

在7 个hERG 阳性药物药理学验证实验中，每次实验需要连续监测6 块化合物板。每个化合物板只有每个待检
测化合物的一个浓度，每个化合物重复24 个孔。第一块化合物板的浓度最低，第六块化合物板的浓度最高。

在7 次独立的实验中各自得到一个量效曲线和相应的IC50 值。图3 展示了一个代表性实验中得到的药学曲线。

化合物多次添加方法的数据重复性检测

筛选实验中数据的稳定性是非常重要的。采用前述已优化好的实验条件，所有七次阳性hERG 抑制剂的药理学数据均表现出良好的可重复性。六次化合物添加实验的稳定性展现在图4 中。这种稳定性尤其重要，体现在加样后及施加电压刺激后的稳定电流记录的技术要求方面。

其中一个检测的阳性药物，哌咪清（Pimozide） ，观察到其重复性低于预期。这可能与化合物的高亲脂性相关，从而造成了化合物在筛选过程中多数的塑料材料环境下的不稳定性。

总结

本次实验验证了单孔多次加样方法在保证数据质量的前提下，可以显著增加通量且降低运行成本。
• 通量显著的从 1100增加至4600个数据点每小时。
• 药理学结果方面，单次加样和多次加样的IC50值保持很好一致性。
• 整个实验结果保持稳定性和重现性
• 累积浓度效应数据类似于传统膜片钳技术方法

参考文献

Application protocol: “Validation of the IonWorks Barracuda System for hERG Ion Channel Assay”, by Karen Cook, M.S., James L. Costantin, Ph.D., and Xin Jiang, Ph.D.,Molecular Devices, LLC (2011)