揭示寨卡病毒RNA结构及固有免疫MAVS信号通路调控分子

　　本周，Cell Host & Microbe 杂志在线发表了两篇来自国内学者的研究论文。

　　第一篇是由清华大学张强锋课题组与谭旭课题组联合发表的题为Integrative Analysis of Zika Virus Genome RNA Structure Reveals Critical Determinants of Viral Infectivity 的研究论文。论文对寨卡病毒的RNA基因组在二级结构层次进行了综合分析和建模，并在此基础上发现且验证了一个只在流行株系中特异性存在的长程RNA-RNA相互作用，研究表明该相互作用可能促进寨卡病毒流行株系的细胞感染功能。论文显示了RNA二级结构对寨卡病毒的重要作用，阐释了调控RNA病毒传染性和毒性的新型分子机制，为相关药物开发提供了重要的结构基础。

　　寨卡病毒（Zika virus ，ZIKV）是黄病毒科黄病毒属的RNA病毒，经由斑蚊传播【1】，感染人群可罹患严重的脑部疾病，包括新生儿的小头畸形和成人的格林巴氏综合症【2,3】。ZIKV的基因组是一条长为一万个核甘酸左右的正链RNA，其中包括编码全部11个病毒蛋白的编码区以及5’端和3’端的非编码区域，依据其基因序列可分为古老非洲株系及流行性亚洲株系（又称美洲株系），其中亚洲株系是造成ZIKV大规模传播的主要病毒株系【4】。然而，比较基因组的分析结果表明，ZIKV的流行株系和非流行株系的大部分基因组差异并不带来氨基酸的变化，而是发生在非编码区的突变和编码区的同义突变。这些在蛋白层次“沉默”的突变有可能在RNA层次造成功能和调控的差异。然而由于技术的限制，人们对此所知甚少。

　　黄病毒属的基因组RNA可参与病毒的翻译，复制，包装及入侵宿主等过程，其中RNA结构元素发挥了重要作用【5】。在本篇研究论文中，研究人员研究者综合利用了两种新型基于高通量测序技术的RNA二级结构研究手段，平行解析并比较了亚洲株系和非洲株系的寨卡病毒在哺乳动物细胞内的基因组RNA结构。研究人员首先选取了ZIKV亚洲型代表病毒株PRVABC59及非洲型代表病毒株MR766感染Huh-7细胞，并采用小分子修饰结合深度测序探测RNA二级结构的icSHAPE（in vivo click selective 2-hydroxyl acylation and profiling experiments）方法检测了RNA核苷酸的柔性结构【6】，同时利用分子交联并结合深度测序检测RNA分子相互配对作用的PARIS（Psoralen Analysis of RNA Interactions and Structures）技术直接描绘ZIKV基因组RNA-RNA配对情况【7】（图1）。研究人员对测得的icSHAPE和PARIS数据和已知病毒RNA元件的二级结构进行了完整比较，验证了两种技术解析病毒RNA结构的有效性。以PARIS数据为依据，对寨卡病毒RNA基因组进行了RNA结构域的划分，并在结构域的基础上，结合icSHAPE数据和RNA结构预测软件，构建了亚洲和非洲株系寨卡病毒全基因组RNA的二级结构模型。

图1. 结合icSHAPE技术和PARIS技术解析寨卡病毒中的关键RNA结构元件

　　结合 PARIS数据和ZIKV各亚型的系统进化分析，研究人员从中发现了一个亚洲株系特异的5’端非编码区和病毒包膜蛋白编码区之间的长距离RNA-RNA相互作用。在这个区域，亚洲株系相对于非洲株系有很大的核苷酸差异。这些差异都特异的位于氨基酸密码子的第三位因而不影响编码蛋白，但却形成了亚洲株系中特异RNA相互作用的基础。研究者对这个RNA-RNA相互作用进行了突变和回补实验，验证了其对亚洲株系的重要性，如果破坏该相互作用会大幅降低 在神经胶质瘤细胞中的感染性。

　　因此，本研究不仅揭示了RNA二级结构对于病毒感染性调控的复杂性和重要性，而且为病毒的基因组组成和进化，开发新型基于RNA的抗病毒药物提供了研究基础。

　　清华大学生命学院张强锋研究员和药学院谭旭研究员为本文的通讯作者，CLS项目博士生李盼、生命学院博士生魏逸凡、梅淼和PTN项目博士生唐磊为本文共同第一作者。

　　第二篇是来自浙江大学生命科学研究院张龙课题组发表的题为FAF1 Regulates Antiviral Immunity by Inhibiting MAVS but Is Antagonized by Phosphorylation upon Viral Infection的研究论文。论文发现了支架蛋白FAF1可形成聚集体并负调控MAVS信号通路。FAF1可与TRIM38竞争与MAVS的结合并拮抗MAVS蛋白的多聚泛素化及聚集体的形成。病毒感染后，FAF1第556位丝氨酸可被激酶IKKε磷酸化并起始FAF1的溶酶体降解途径，从而释放FAF1对MAVS的抑制作用，激活免疫应答。

　　病毒RNA感染宿主细胞后可激活RIG-I-MAVS信号通路。病毒RNA首先被胞质感受器RIG-I（retinoic acid-inducible gene 1）所识别，将信号转导于定位在线粒体的MAVS（mitochondrial antiviral signaling protein）并激活信号级联网络，促使转录因子NF-κB与IRF3入核并诱导I型干扰素的产生【8,9】。其中，MAVS在中心起到了承接病毒识别并结合及起始下游抗病毒信号的功能。RIG-I的CARD结构域可与MAVS N端CARD结构域相互作用，诱发MAVS蛋白形成朊蛋白样聚集体，激活转录因子NF-κB与IRF3【10】。体外重组实验证实了MAVS聚集体的形成需要RIG-I及TRIM31催化的MAVS K63位多聚泛素化的形成【11】。然而，MAVS功能的精确调控有赖于更多的研究进行阐明。

　　在本篇研究论文中，研究人员首先利用质谱鉴定到FAF1可与MAVS发生相互作用。FAF1的UBL结构域对于相互作用不可或缺。FAF1可形成聚集体，RNA病毒感染后，FAF1的表达抑制了抗病毒因子的表达。随后，研究人员在小鼠体内巨噬细胞中条件敲除性FAF1基因，发现FAF1的缺失可显著诱导宿主的抗病毒免疫应答并抑制病毒在体内的负责。机制上，FAF1与TRIM31竞争性结合MAVS，从而抑制MAVS K63位多聚泛素化的形成并抑制MAVS聚集体的形成。FAF1的缺失则可回复这一过程，因此，FAF1在MAVS信号通路中发挥负调控作用。

　　研究人员进一步探究在RNA病毒感染后FAF1蛋白表达减少的机制，发现FAF1是溶酶体降解途径的靶蛋白，这一现象依赖于激酶IKKε的表达。质谱结果显示，FAF1第556位丝氨酸（S556）可被IKKε磷酸化且S556在进化中具有非常高的保守性。FAF1 S556的磷酸化促使FAF1 UBL结构域四个赖氨酸位点（K139，K143，K146和K221）发生乙酰化并诱导FAF1的解聚和降解。因此，FAF1 S556的磷酸化对于FAF1的降解及MAVS的激活发挥了重要作用。

　　总的来看，本篇研究论文不仅系统性的鉴定到了固有免疫新型分子FAF1在MAVS信号通路中的发挥的负调控作用，而且揭示了FAF1与MAVS相互作用调控免疫信号通路的重要机制（图2）。

图2. FAF1调控MAVS信号通路示意图

　　参考文献

　　1. Petersen, L.R., Jamieson, D.J., and Honein, M.A. (2016). Zika virus. N. Engl. J.Med. 375, 294–295.

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　　3. Cugola, F.R., Fernandes, I.R., Russo, F.B., Freitas, B.C., Dias, J.L., Guimaraes,K.P., Benazzato, C., Almeida, N., Pignatari, G.C., Romero, S., et al. (2016). The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature 534, 267–271

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　　11. Liu, B., Zhang, M., Chu, H., Zhang, H., Wu, H., Song, G., Wang, P., Zhao, K., Hou, J., Wang, X., et al. (2017). The ubiquitin E3 ligase TRIM31 promotes aggregation and activation of the signaling adaptor MAVS through Lys63-linked polyubiquitination. Nat. Immunol. 18, 214–224