开发验证与质量管理关注质谱技术临床应用

　　分析测试百科网讯 2018年4月25日-27日，由复旦大学附属中山医院检验科主办、国家级I类继续教育学习班——“液相色谱-质谱技术临床应用培训班”在复旦大学附属中山医院独山厅举办。本次活动围绕LC-MS/MS技术在我国临床检验领域的应用，邀请了国内外著名专家教授，向学员们讲授了液相色谱-质谱检测技术的基本理论、平台建设、研发与验证、质量管理、临床应用、常用检测项目和相关解决方案等方面的知识，共吸引140多位来自国内各大医院的检验技术人员和相关单位的工作人员参加。

液相色谱-质谱技术临床应用培训班现场

　　26日上午的培训主题是“液相色谱-质谱检测方法的研发与验证”，由复旦大学附属中山医院检验科副主任郭玮教授主持，杭州凯莱谱精准医疗检测公司CEO刘华芬博士、复旦大学附属中山医院检验科质谱团队陈方俊和美国宾夕法尼亚州立大学Hershey医学中心实验室负责人朱玉胜教授分别为学员带来精彩的培训报告。

杭州凯莱谱精准医疗检测公司CEO 刘华芬博士

　　杭州凯莱谱精准医疗检测公司CEO刘华芬博士的报告题目是《液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）实验方法开发》。高端临床医学检验仪器发展包括生化分析方法，免疫分析方法，化学发光分析方法（免疫法）和精准检测（基因测序+质谱）。精准检测不存在抗原抗体交叉反应，不易有假阳性；一次进样，检测多种指标，节约大量血清；监测代谢通路中多个指标，进行疾病的精准诊断；开放平台可按需自建LDT。

　　实验室常见质谱种类包括LC-MS/MS液相色谱-串联质谱（小分子定量分析），GC-MS气相色谱-串联质谱（挥发性化合物检测、尿液有机酸分析），QTOF MS/Orbit飞行时间/轨道离子阱分析器（多肽、蛋白质、未知物鉴定），MALDI-TOF MS基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（多肽、蛋白、寡核苷酸检测、微生物鉴定、SNP基因检测）和ICP-MS电感耦合等离子体质谱（元素分析）。

　　LC-MSMS在临床应用中具有特异性高，选择性好，适合复杂基质和有干扰检测项目；灵敏度高适合体内含量低的物质；可用于多组分分析，如药物筛查和新生儿筛查等；灵活性高，可根据需求开展LDT项目；方法开发省时省力，可降低大批量检测成本；内源性小分子标志物的金标准。

复旦大学附属中山医院检验科质谱团队 陈方俊

　　复旦大学附属中山医院检验科质谱团队陈方俊带来题为《样本前处理技术在临床LC-MS检测中的应用》的精彩报告，介绍了常见的样本前处理方法，包括蛋白沉底啊烦，液液萃取法和固相萃取法，稀释后进样（DIL），磷脂去除（PLR）和支撑液液萃取等。

　　样本前处理可以使样本的基质从复杂基质（血液、血浆、尿液）转化为更简单的基质，防止色谱柱的堵塞和MS的损坏；提升质谱检测的终浓度，从而提高检测的灵敏度；使样本进样基质同流动相初始比例相互匹配。

　　如何科学选择前处理方法？第一考虑待测物的分子本质，待测分子在不同有机相中的分配系数（是否使用液液萃取）、酸碱程度（SPE填料的选择）、和同蛋白结合情况都将决定使用的前处理方法（蛋白沉淀或超滤）。第二要考虑打到LLOQ所需的浓缩和稀释，治疗药物监测一般不需要浓缩，而内源性激素一般需要浓缩。第三要根据实际情况进行调整，例如质谱的灵敏度、方法的资金预算、样本通量是否过大而需要容易规模化自动化的前处理方法等。

美国宾夕法尼亚州立大学Hershey医学中心实验室负责人 朱玉胜教授

　　美国宾夕法尼亚州立大学Hershey医学中心实验室负责人朱玉胜教授带来的报告题目是《LC-MS/MS检测方法开发与验证的基本要求》，介绍了LC-MS/MS的相关指南，方法开发的基本步骤和方法验证的参数等。

　　现行的相关指南中，C62-A指南旨在减少实验室间临床LC-MS/MS检测方法开发与验证的差异，提出了LS-MS/MS检测方法开发与验证的标准方案。C62-A指南的内容包括LC-MS仪器的重要特性，影响检测方法性能与效用的检测前因素，方法校准，方法开发过程中重要的分析变量，方法验证，质量评价与质量控制，临床检测项目开展后的监控等。

　　色谱方法的开发可以沿袭既往方法，根据分析物在特定PH条件下的亲和性选择色谱柱，选择流动相缓冲体系，选择等度vs梯度分离、优化流速，选择添加剂等。

　　下午的培训主题包括“液相色谱-质谱检测的质量管理”和“液相色谱-质谱临床应用”，分别由克利夫兰医疗中心临床生化主任及医学总监、美国临床化学学会（AACC）转化医学部门主席、临床化学鉴定委员会（ComACC）主席王思合教授，MSACL委员会成员、不列颠哥伦比亚大学检验科主任、维多利亚大学医学部客座教授Michael CHen博士，复旦大学附属中山医院检验科郭玮教授，广州金域临床质谱检测中心主任、广州医科大学金域检验学院程雅婷教授，上海交通大学医学院附属新华医院韩连书教授带来精彩的培训报告。

克利夫兰医疗中心临床生化主任及医学总监、美国临床化学学会（AACC）转化医学部门主席，临床化学鉴定委员会（ComACC）主席 王思合教授

　　克利夫兰医疗中心临床生化主任及医学总监、美国临床化学学会（AACC）转化医学部门主席，临床化学鉴定委员会（ComACC）主席王思合教授带来的报告题目是《临床LC-MS实验室的质量管理》，介绍了临床实验室中相关的CLIA’88和CLSI指南，LC-MS检测方法中的FDA指南、CLSI指南和经验等。CLIA条例对以诊断、预防或疾病治疗、健康评估为目的的人血、体液及组织样品实验室检测确立相应质量标准。

　　好的检测质量始于方法开发，要满足临床需求而非追求检测卓越性，例如25-羟基维生素D；力求简约，包括样本制备、色谱条件和质谱条件；尽量稳健，不依赖于使用者与时间、灵敏度留有缓冲余地。通过验证是确保质量的重要步骤，全面评估方法，寻找日常操作中可能出现的潜在问题，在项目开展前把问题解决，确保性能持续性，避免非必需干预。

　　临床实验室必须参与替代能力测试，以确保可观的质量评估，必须审查和评价能力测试结果，所有的能力测试及验证活动必须形成文件。当发现分析质量问题是应努力找出根源，日常操作人员应向方法开发团队寻求帮助以进一步排除故障，也可联系厂商工程师进行故障深度排除。如果实验室使用不同方法或仪器进行同一检测或在多个检测地点进行同一检测，实验室必须建立对使用不同方法、仪器或检测地点的检测结果间关联每年进行两次评估确认。

　　LC-MS方法在检验医学中十分重要，质量管理对确保患者诊疗相关检测结果报告的质量而言至关重要，质量管理需包括管理人员、方法开发人员、操作人员和故障排除人员在内的团队一同协力。

MSACL委员会成员、不列颠哥伦比亚大学检验科主任、维多利亚大学医学部客座教授 Michael CHen博士

　　MSACL委员会成员、不列颠哥伦比亚大学检验科主任、维多利亚大学医学部客座教授Michael CHen博士的报告题目是《LC-MS/MS在临床毒理学中的应用及质量管理》。

　　法医毒理学是一门主要应用毒理学的理论和技术，研究与法律有关的自杀、他杀和意外或灾害事故引起中毒的学科，工作流程与质量要满足严格的监管链。临床毒理学药物测试主要类别包括应急毒理学、疼痛或成瘾管理、治疗药物监测、新生儿药物检测和遗传药理学，其检测方法包括免疫试验（酶联免疫吸附试验、酶复合免疫测定技术、克隆酶供体免疫试验、非仪器化免疫测定装置）和分析化学方法（GC-MS、LC-MS）等。

　　GC-MS气质联用技术因其对微量化合物的检测上显示出的可重复性、高选择性和灵敏度而被广泛接受。气质联用技术在药物监测领域已有几十年的应用历史，还将继续成为毒理实验室药物确认分析的明确标准。电子离子化全扫描模式是药物和代谢产物全筛查及系统独立分析的金标方法。LC-MS/MS液相色谱串联质谱具有高灵敏度和高选择性的优点，样品准备要求低，可以更好区分共洗脱化合物，可检测非挥发性以及热不稳定化合物，是毒理测试的新金标。与免疫分析相比，质谱技术更为优越，在临床毒理学已成为金标方法，但免疫分析（POCT）仍然用途广泛。在临床毒理学上，LC-MS/MS的方法开发以及质量控制已很完善，各大实验室都应使用LC-MS/MS做化合物确认。

复旦大学附属中山医院检验科 郭玮教授

　　复旦大学附属中山医院检验科郭玮教授带来题为《LC-MS/MS在临床激素检测中的应用》的精彩报告，从LC-MS/MS的技术，为什么应用LC-MS/MS检测激素和如何规范开展LC-MS/MS技术三个方向展开。

　　通过雌二醇检测、睾酮检测、类固醇检测等实际分析结果显示，采用质谱技术的临床激素检测有检测灵敏度高且低值结果稳定，预处理去蛋白，特异性高，方法开发交易实现以及多物质可同时检测等特点。

　　规范开展LC-MS/MS技术包括LC-MS临床检测的基本要求（实验室基本要求，仪器设备，分析前准备和质量控制）以及LC-MS检测方法的建立、验证与执行。

　　报告指出，LC-MS/MS在临床激素检测中具有高灵敏度、高特异性、高通量的有点，一针进样可检测多种类类固醇激素，LC-MS/MS检测趋于自动化和操作标准化，LC-MS/MS要规范管理和良性开展。

广州金域临床质谱检测中心主任、广州医科大学金域检验学院 程雅婷教授

　　广州金域临床质谱检测中心主任、广州医科大学金域检验学院程雅婷教授带来的报告题目是《串联质谱检测遗传代谢病的方法验证与质量控制》，介绍了质谱技术在遗传代谢病检测中的应用，串联质谱检测氨基酸、有机酸及脂肪酸氧化代谢病，串联质谱检测先天性肾上腺皮质增生症和串联质谱检测遗传代谢病的质量控制。

　　遗传代谢病又称为先天性代谢异常（IMD），是指有异常生化代谢标志物的一大类疾病，其分类包括氨基酸代谢异常，碳水化合物代谢异常，脂肪酸氧化障碍，尿素循环障碍，有机酸代谢异常，核酸代谢异常，金属元素代谢异常，内分泌代谢异常和骨代谢病等。

　　程雅婷副教授在报告中介绍了串联质谱技术检测干血斑中氨基酸、酰基肉碱的检测流程、方法建立和方法验证参数以及先天性肾上腺皮质增生症的发病机制、检测现状等。

　　串联质谱检测遗传代谢病的质量控制包括方法学控制，室内质量控制，室间质评，仪器使用与管理，前处理操作规范化，方法学性能评估，临床沟通及报告解读等。

上海交通大学医学院附属新华医院 韩连书教授

　　上海交通大学医学院附属新华医院韩连书教授的报告题目是《血串联质谱检测结果解读及应用》，介绍了遗传代谢病，串联质谱筛查结果解读原则，串联质谱氨基酸检测结果解读，串联质谱酰基肉碱检测结果解读，串联质谱筛查疾病确诊原则。

　　遗传代谢病是基因突变导致维持机体正常代谢所需的某些酶、受体或载体等功能降低或缺乏，导致机体内某些代谢物的正常代谢途径受阻，代谢底物增加，产物减少引起的疾病。遗传代谢病多为单基因遗传病，大部分属于常染色体隐性遗传病。

　　遗传代谢病检测常用技术包括串联质谱技术，气相色谱质谱技术，基因突变检测，基因芯片检测，二代测序技术，酶活性检测，染色体检测。

　　串联质谱筛查结果需要结合质控品结果、内标离子强度、胎龄、出生体重进行分析；结果显著异常即可确诊；部分疾病需要MSMS级GCMS联合诊断，如MMA、PA、MCD、OTCD、酪氨酸血症等；结果轻度异常可结合基因检测及其他实验室检查综合分析；临床患者需要结合临床表现。