看透一个细胞！科学家为研究单细胞代谢夯实技术

　　Renato Zenobi坐在一楼的办公室里，这是一间通往牧场的工业实验室。这位分析化学家解释了细胞生物学家正面临的一个基本问题。他在跟踪代表理论细胞群中分子平均集中度的一条曲线—— 一条简单的钟形分布曲线。他解释说，这样的分布会隐藏复杂性。为了证明这一点，他画了两条与单峰的每一边相重合的曲线，每个曲线代表群体中的一个典型表型，而且还与那个钟形曲线相一致。“为了弄清楚这个分布是多峰还是单峰，你需要深入到单个细胞层面。”在苏黎世瑞士联邦理工学院（ETH）工作的Zenobi说。

　　细胞异质性是克隆种群中的一些细菌发展出抗菌素耐药性的原因。它会导致大脑中产生不同的细胞亚种群，并解释了肿瘤固态萌发。然而，监测这些不同点的工具才刚刚起步。

　　“目前的技术进步，尤其是那些过去两年中的技术进步已经揭示了同一群细胞中的个体细胞可能存在巨大差异。”马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院（NIH）共同基金单细胞分析工作组项目负责人Ananda Roy说，“这些不同会对健康和疾病产生重要影响。”

　　全世界的资助者都在排着队支持单细胞研究。NIH从2014年开始投入了200万美元，支持单细胞分析的特别计划，目前该项目下属的60个团队获得了奖励。日本高校和公司合作启动的单细胞测量员协会为单细胞分析和技术颁奖并举办研讨会。2016年10月，专家讨论启动国际人类细胞图谱倡议，该倡议旨在绘制每一种人体细胞及其特征，这一雄心勃勃的任务极度依赖单细胞分析。

　　小而踏实的前进

　　分析单个酵母细胞让Zenobi的团队发现了潜伏在基因相同样本中的两个表型，一个叫作左旋糖1.6—二磷酸的低水平代谢物，另一个代谢物水平则较高。这一不同归根结底可能是不同的葡萄糖使用策略。这一发现并没有即时性的生物医学应用，Zenobi说，但它却照亮了细胞工作的基本方式。

　　为了得到这些信息，Zenobi的团队利用精妙的技术分离细胞，提高其分析途径的敏感性。Zenobi利用一种特殊的硅片，每个硅片可向质谱仪传递数百个单独的细胞。对于肉眼来说，这些硅片似乎覆盖着一层精细的网眼。这些网眼是叫作聚硅氮烷的一种聚合物外层，它经过激光微机械产生了数百到数千个储藏库，每个储藏库的直径为两三百微米。

　　Zenobi的研究生Robert Steinhoff展示了这些硅片如何适应一台质谱仪。研究人员利用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）与飞行时间分析器相结合，这需要他们用化学基质驱动离子化。通过使用让小分子生成的信号最小化的干扰矩阵，该团队可以检测到低埃摩尔范围内（10~18摩尔）的代谢，这样做时每个硅片约有1000个细胞，在单细胞世界中这一通量相对较高。

　　而伊利诺伊大学香槟分校分析化学家Jonathan Sweedler则研发了一种高通量方法，利用一台计算机将激光导向铺陈在一个硅片上的单个细胞。该团队通过这种方式可用每个硅片处理约1万个细胞。但为了更综合地观看代谢机制，Sweedler每次仅分离一个细胞。他用一种经过修改的膜片钳工具（它可以典型地记录电子信号），从人类大脑细胞中提取了约3皮升的细胞质（相当于总量的10%~40%），并将其传递到质谱仪内。

　　这些有限通量使每次实验的分析仅局限在几十个细胞。尽管如此，Sweedler的团队已经用它检测了来自大鼠脑切片的30个神经元和星形胶质细胞的约60次代谢。该团队聚焦诸如谷氨酸盐等神经化学物质，还探测了氨基酸和三磷酸腺苷（ATP）的衍生物等。

　　不同大小 不同探测

　　在处理单细胞时，大小非常重要。植物细胞的直径可从10微米到100微米不等。哺乳动物细胞倾向于更小，约为10~20微米。微生物细胞更小，可以达到亚微米级。由于细胞大小不同，代谢物的容量以及确切数字也会不同。“从分析视角来看，非常明确没有任何单一的方法能够应对这些容量。”华盛顿特区乔治华盛顿大学化学家Akos Verte说。他的实验室利用不同方法分析不同大小的细胞。

　　对于最大的细胞来说，该团队用锐化的光纤向细胞内直接传递红外光。光纤刺激了氧—氢在细胞内的水中结合，导致细胞爆发，喷射出其内容物。这些溢出的物质会碰到一种雾化、电离的液体，即电喷雾，它可以使分子带电进行质谱分析。这种技术的优势是当单个细胞仍然镶嵌在组织内时就可以被分析。但它可能非常缓慢，因为每个细胞通常需要“一名极有耐心的研究生”用纤维刺探，Vertes说。他近日利用一台计算机操控样本台，将这一程序自动化。

　　最小的细胞被放置在一个纳米柱覆盖的表面，它也是用硅制成，尽管与Steinhoff的设备的制造方法不同。对整个表面成像揭示了该设备的离子束需要在哪里靶向单个细胞。利用这种方法，该团队能够常规地探测飞克分子（毫微微克分，10~15摩尔）的代谢水平。但研究人员推测他们探测的更低限度是800仄普托摩尔（1仄普托摩尔等于10-21摩尔）或者约48.2万个分子。

　　它甚至还可以到达更小的层面。瑞典哥德堡大学生物分析化学家Andrew Ewing分析了神经囊泡的小分子内容物。Ewing利用一种叫作纳米级二次离子质谱分析（NanoSIMS）的方法，该方法用高能铯离子束轰击一个样本的表面。这一攻击会驱逐表面的带电粒子，它们可以通过质谱仪分析来决定物质的构成。Ewing团队利用这种方法评估了神经囊泡多巴胺的分布。

　　在日本大阪理化学研究所（RIKEN）量化生物中心，化学家Tsutomu Masujima利用一段播放靶向用于质谱仪的单个细胞。“单个细胞的行为非常有趣和出乎意料，所以我喜欢尽可能多的看到它们。”Masujima说。

　　他的方法涉及在视频观察中向细胞内直接插入一个纳米流喷雾针，吸出内容物，然后利用同样的针将内容物注射到质谱仪中。加入视频构成元素让他的团队可以完成更加精细化的操作，比如捕捉和分析氨基酸与血液中单个白血细胞和肿瘤细胞的脂含量。它还让该团队评估分子的丰富程度。

　　让数据合理化

　　幸运的是，带领加州斯克里普斯代谢组学和质谱分析中心的化学家Gary Siuzdak说，可以获取生物信息学工具让这些发现合理化。Siuzdak的中心经营了一家基于云的代谢物分析平台，名字是XCMS在线，该平台的1.2万多名用户已经分享了超过12万项工作。Siuzdak承认，那些工作中很少涉及单细胞，但这并不意味着它们天生的与那些软件不相容。“在生物信息学方面，我没有看到开展这些实验的主要问题。”他说。

　　相反，单细胞代谢领域的主要挑战是仪器：能有足够研究单个细胞以及每个细胞代谢物的设备，这样的研究结果在数据上才能有意义。“单个细胞的主要问题是硬件仍需提高。”Siuzdak说。研究倾向于分析数十个或是数百个不同的分子。但单个酵母细胞拥有约600种代谢物。因此，即便是最敏感的分析技术也只能选择最容易探测的对象，最常见的是单个细胞内的分子。那些不常见的则处于雷达探测范围以外。

　　该问题的一个潜在解决方法可能在于基于数量的工具和各种组学之中。“为代谢物数据集开发的通道和工具来自大量可再利用的细胞群。”他说。所需要做的全部是对研究人员使用的数据处理和归一法的略微调整。“单个细胞转录组学已经建立了，我们可以从中学习加速针对单个细胞代谢物领域的生物信息学发展。”他补充说。

　　其他研究人员在追逐基于质谱仪之外的单细胞分析策略，特别是利用活体细胞。在谈及单个细胞代谢物研究时，关键的技术挑战已经被解决，Heinemann说。“现在需要做的是进行单调的开发和有效的工作”。

　　“我们经常会非常高兴地探测独特的分子，我的问题是为什么要这样呢？”Masujima问道，“这项发现的背后是什么？这个分子为什么会出现？”如果没有这样的洞察，技术会冒仅仅是赚取噱头而不能解决生物学重要问题的风险。“我不想成为做这种科研的科学家。”他说。