科学家建立跨分化阶段高通量谱系示踪新技术

2023年3月18日，《Cell Stem Cell》期刊以封面文章的形式在线发表了中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、神经科学国家重点实验室陈跃军研究组题为《人神经分化过程中跨时间段的克隆谱系追踪》的研究论文，该研究通过建立能够跨分化阶段高通量谱系示踪新技术-SISBAR，解析了人多能干细胞分化为人腹侧中后脑神经细胞的单细胞谱系，发现了许多新的谱系分化路径和分子调控机制，研究进一步展示了基于SISBAR技术的新发现在改进帕金森症细胞治疗策略中的应用。SISBAR技术有望为干细胞研究带来新的突破。 

发育与干细胞生物学中的一个基础性问题是如何解析生物体内不同细胞类型之间的发育谱系关系。解析这些谱系关系能够更加深入地解析生命体的正常发育过程以及病理状态（包括癌症与发育障碍）下的分子机制，为操纵在体细胞分化命运，优化体外细胞分化方法，以及促进基于细胞替代疗法的再生医学的发展提供线索。然而，经典的正向谱系追踪和逆向谱系追踪方法，主要用于解析同一个分化/发育时间点不同细胞类型之间的谱系关系，而不能同时提供在上一个阶段与它们有亲缘关系的前体细胞的身份特征。如何持续地追踪细胞在多个分化/发育时间点的细胞状态，从而描绘更完整的细胞发育路径，是发育学领域中亟待解决的问题。 

针对以上问题，团队成员通过结合病毒介导的细胞条形码标记技术、单细胞测序技术，以及克隆分离策略，开发了SISBAR技术，并应用在基于人多能干细胞的神经分化模型中。SISBAR技术可以跨分化阶段追踪单个前体细胞衍生的谱系克隆，同时获取该前体细胞的单细胞转录组信息（图A）。研究团队一直致力于人多能干细胞神经分化技术的开发和神经系统疾病的细胞治疗研究，建立了将人多能干细胞分化为人腹侧中脑和后脑细胞的方法，其中包含能够用于帕金森症细胞替代疗法的关键细胞类型–中脑多巴胺能神经元（2016 Cell Stem Cell; 2021 Cell Stem Cell; 2022 JCI）。 

团队成员把SISBAR技术应用于人腹侧中后脑的体外分化体系，并建立了“潜能视角”和“起源视角”的谱系分析方法来分别解析由转录组定义的不同细胞类型的分化潜能及分化起源，从而构建了一个多层级的谱系树来描绘整个分化过程（图B）。这一多层级谱系树揭示了中后脑细胞分化过程中许多之前未被报道过的发散型和汇聚型跨阶段谱系分化路径。团队的研究还揭示了跨分化阶段的群体水平谱系和克隆水平谱系之间的关系：在发散型谱系关系中，发现同种类型的前体细胞（单细胞转录组定义的细胞簇）中单个前体细胞的命运可以不同；不同前体细胞差异的分化命运的集合代表了该前体细胞类型在群体水平的分化命运。在汇聚型谱系关系中，发现同种类型子代细胞中的单个细胞可以有不同的谱系起源，并且这些不同来源的子代细胞会带有其亲代细胞独特的基因印迹（图C-D）。

研究团队进一步展示了基于SISBAR技术的跨分化阶段谱系关系和相关分子调控机制的解析在神经系统疾病细胞治疗中的应用。利用SISBAR技术，研究团队发现中脑多巴胺能神经前体细胞具有至少三种命运分化潜能，包括中脑多巴胺能神经元、中脑谷氨酸能神经元、血管软脑膜样细胞（VLMCs）。研究团队还鉴定了早期中脑多巴胺能神经前体细胞的特异性表面分子标记物APCDD1（图E）。将表达APCDD1的神经前体细胞进行流式分选并移植到帕金森病模型小鼠的纹状体后，移植物中目的细胞-中脑多巴胺能神经元的比例得到了显著提高（图F）。并且，与通过SISBAR技术发现的中脑多巴胺能神经前体细胞多分化潜能的结果一致。研究团队在APCDD1分选的移植物中检测到了中脑谷氨酸能神经元和一种血管软脑膜样细胞的存在，这一结果展示了SISBAR技术在改进细胞治疗策略和预测移植细胞体内分化命运中的应用。 

基于人多能干细胞的细胞替代疗法在治疗许多用传统药物难以治愈的疾病（如帕金森症）方面具有广阔的应用前景。然而，人多能干细胞分化得到的供体细胞（细胞药物）存在显著的异质性，这将导致供体细胞和移植物中目的细胞的低比例和细胞组成的不稳定性，阻碍了细胞替代疗法在临床上更广泛地应用。可以预见的是，作为一种通用型技术，SISBAR能够广泛地应用于包括神经分化在内的基于人多能干细胞的体外分化系统中，构建整个分化过程的谱系发育树，解析谱系分化的分子调控机制，使我们更好地理解目的细胞和非目的细胞在分化过程中产生的机制，从而改进细胞治疗策略，获得更安全稳定的细胞治疗结果。同时，SISBAR还为我们解析细胞分化/发育过程中的谱系关系提供了新的方法和视角，是经典谱系追踪方法的重要补充。本研究中群体水平谱系和克隆水平谱系关系的解析，为我们理解细胞分化分过程中复杂而精确的细胞命运决定事件提供了重要的理论基础。 

该研究由中科院脑智卓越中心博士研究生游致文与中科院营养健康所王露悦博士，在脑智卓越中心陈跃军研究员和临港实验室魏武研究员的指导下完成，中科院脑智卓越中心何慧博士、吴子彦博士、章馨月、薛帅翔、许培博博士，职工张晓、刘兵，中科院营养与健康所洪延泓，复旦大学脑科学研究院熊曼研究员，复旦大学附属肿瘤医院胡欣研究员为本研究提供了重要帮助。本研究得到了中科院、科技部、基金委和上海市科委的资助。 

　　图注：（A）用于跨时间点克隆谱系追踪的SISBAR实验设计示意图。（B）跨越四个分化阶段多层级谱系树，展示了不同分化时间段不同细胞类型之间显著的遗传谱系关系。（C-D）两种不同的汇聚型谱系分化路径示意图。（E）特异性表达在中脑多巴胺能神经元早期前体细胞中的基因。（F）未分选的神经前体细胞和APCDD1+神经前体细胞衍生的移植物典型图和移植物中TH+神经元的比例，hN，人源细胞核。比例尺，大图中为100 μm，小图中为20 μm。 

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