科研“撞车”后另辟蹊径，6年研究终发顶刊！

　　在科研界从事最热门的研究是有风险的。因为大家都在争分夺秒，同类型的研究被抢先发表的情况经常出现。

　　美国华盛顿大学教授古良才团队也经历了这扎心一幕。

　　他们从6年前开始用自己开发的DNA芯片研发超高分辨空间转录组技术——Pixel-seq。2021年初，这项技术与另外两种同类型技术的预印版几乎同时在bioRxiv上发表。然而，后两者相继发表在Cell上。

　　团队成员感受到了来自竞争对手的压力。与那两个拥有公司成熟芯片工艺支持的技术不同，Pixel-seq基于实验室自产的芯片。当时的核心成员包括古良才在内只有4人。这样一个规模很小的大学实验室却需要完成材料优化、测序平台搭建、分子生物学验证、与复杂数据分析等一系列工作。但是他们顶住了压力，给最初的技术方法注入了新鲜的“血液”——开发出了打印技术，通过DNA芯片上的“活字印刷术”，成功站在竞争的最前端。

　　2022年11月10日，Cell在线发表了这项突破性芯片打印技术和单细胞空间转录组技术，该技术把同类技术的空间分辨率提到了新的高度，同时将芯片成本降级了两个数量级。

　　华盛顿大学的博士后付笑男为论文第一作者，高级研究员、工程师孙立博士与博士生董润泽为论文共同第一作者，古良才为论文通讯作者。

　　照片中从左至右分别是董润泽、孙立、古良才和付笑男。 受访者供图

　　DNA芯片需要越来越高的分辨率

　　基于DNA芯片的空间转录组技术是科研“出圈”的热点技术，已然成为学术界和工业界的“香饽饽”，早在两年前就被Nature Methods评为年度技术。

　　但如果想产生革新性的改变，DNA芯片就要不断提高分辨率。

　　因为在人体里现有已知的几百种细胞，一般直径10微米到100微米不等。如果空间组学的分辨率不够，就无法分辨出单个细胞。比如说，现阶段实现商业化的空间转录组技术，10x Genomics公司的Visium技术，其DNA芯片的分辨率为55微米。如果采用该技术对人体组织进行分析，无法实现DNA芯片的点阵单元捕获来自同一细胞的转录组信息。只有将DNA芯片的分辨率逐渐提升，才有可能真正实现单细胞水平的空间转录组分析。

　　首先，古良才团队提高分辨率的方法是让DNA芯片的点阵单元足够小。点阵单元就像是DNA芯片的“像素”，越小、越密集的点阵单元，意味着可以实现更高的空间分辨率。

　　“我们可以把点阵单元的直径做到等于或小于1微米，这一分辨率基本可以实现大量的点阵单元只捕获来自一个细胞的转录本，然后只需要用计算的方法将捕获属于同一细胞的位置相邻的点阵单元划分在一起，就可以基本实现单细胞水平的空间转录组技术了。”付笑男在接受《中国科学报》采访时表示。

　　其次，他们采取聚丙烯酰胺胶作为DNA芯片的基底，这样可以把模板的扩散控制在小于1微米的范围内，防止了细胞之间转录模板的扩散，有效提高了空间组学的分辨率。

　　团队最终开发出全新的高密度、以聚丙烯酰胺胶为基底的DNA芯片，并将它命名为polony gel。

　　“polony gel运用于空间转录组学，就是我们新的单细胞空间转录组技术——Pixel-seq，这使得这类技术的空间分辨率和检测灵敏度得到了有效的提升。”付笑男表示。

　　论文登上cell

　　与别人的研究“撞车”，如何翻盘？

　　去年6月，Cell就已发表了密歇根大学医学院的一篇文章，该成果是基于因美纳（Illumina）测序芯片的亚微米分辨率空间转录组学技术Seq-Scope。其特点是把商业化的平台做了一个改造，这样可能对于那些熟悉因美纳芯片的科研人员而言更容易上手。

　　而今年5月，Cell又发表了华大基因（BGI）自主研发的Stereo-seq。它的优势在于利用Complete Genomics公司开发的DNA纳米球测序平台，BGI官网称其是超广角百亿像素“生命照相机”的时空组学技术。

　　两篇同类型技术论文的提前发表似乎对Pixel-seq的发表造成了困难。

　　其实长时间以来，团队一直在思考如何在激烈的竞争中找寻自己的技术优势。他们发现，答案在于如何解决DNA芯片领域“卡脖子”的难题——高昂的制造成本。

　　古良才举了一个例子。Seq-Scope与Stereo-seq报道的芯片成本分别是每平方毫米150和35美元，如果要分析一平方厘米的组织切片，即使实验一次成功不需任何重复，芯片的成本就已经高达15000和3500美元。

　　古良才曾经设想：“如果制造DNA芯片能像‘活字印刷术’一样进行反复复制，就能极大地降低成本。”虽然历史上一直有人不断尝试复制DNA芯片，但是从来没有实验室能复制这类高分辨率的芯片。

　　“解决这个多年难题的关键在于优化自己研发的芯片的聚丙烯酰胺胶基底，而实现这一点完全是依赖团队多年在底层技术研发上的积累。相反如果仅仅使用商业化的芯片是无法实现这一突破的。”古良才在接受《中国科学报》采访时表示。

　　团队设计完成了在DNA芯片上的“活字印刷术”，可以借助机械臂完成DNA簇的重复印刷，将芯片的成本降低到每平方毫米6美分，生产时间降低到7小时。

　　“原本我们是想把这种印刷技术单独放到另一篇文章里发表，没想到当时我们的空间转录组研究与别的课题组‘撞车’了。所以我们选择把原本计划分别发两篇的成果合成一篇。”古良才说。

　　拥有新优势的Pixel-seq投稿过程非常顺利，Cell的编辑认为该研究创新性很高。对于文中实现的重复印刷技术，三位审稿人都感到很惊喜，返回的审稿意见都非常正面，文章做了一些较小的修改后，很快便被正式接收。

　　“在我的认知里，投Cell这样的期刊，文章大多会来个大修，审稿人会很挑剔，有很多意见和建议。但没想到我们的整个投稿过程超乎想象的顺利。”董润泽在接受《中国科学报》采访时说。

　　“我们一直在做真正意义的底层研发，例如实验用到的各类测序芯片全是由我们实验室从原材料开始制造的。别看我们团队不大，但‘麻雀虽小五脏俱全’，我们一个团队涵盖了公司里面很多职能和环节。更底层的创新才能把成本降到最低，真正克服空间转录组应用的‘卡脖子’的难题。”古良才说。

　　“接下来，我们计划将polony gel芯片印刷技术运用于芯片的大规模量产，让其在更多领域‘发光发热’，比如单细胞、亚细胞空间多组学等挑战性更强的研究领域。”古良才表示。

　　做研究，必须具备更超前的视野

　　这项研究的开启得回溯到2016年。

　　师从美国两院院士、哈佛医学院大牛George Church的古良才2015年在华盛顿大学组建了自己的实验室，并开始在全世界招揽人才。在空间转录组方兴未艾的那个时候，古良才就已经决定进军这个领域，并设定了在那个时候看来是大胆而超前的目标：实现单细胞水平的空间转录组技术。

　　受到2016年Science发表的第一篇基于DNA芯片的空间转录组工作的启发，古良才和孙立迅速开始研发基于polony gel的DNA芯片。当时实验室急需具有分子生物学和二代DNA测序背景的人才加入团队。

　　而本科就读于华东师范大学、在美国弗吉尼亚理工大学获得博士学位的付笑男，正好看到了那则招聘启事。实验、数据分析都不在话下的他，顺理成章地进入组里做博士后。

　　“我是最开始测试将实验室制备的polony gel用于空间转录组的人，因为在我之前，他们还没有合适的人选。研究前期，基本上就只有我、孙立和古老师在做。后来几年，队伍才逐渐壮大起来。”付笑男说。

　　一项创新成果的诞生，需要肥沃的知识土壤。

　　在古良才的团队里，就有着各专业人才孕育这种土壤，比如分子生物学、数学、统计学、生物信息学、生化、材料、机械、神经生物学等。这项研究最大的挑战，也正是融合了多个学科的知识和技能。

　　“别看只是一篇论文的发表，我们这么走一遭，可以说各方面能力都得到了锻炼。那时候，我主要负责Pixel-seq的设计和开发，既要采集数据，同时也要做生化，跨学科掌握了许多专业知识。每天都过得很充实。”付笑男表示。

　　孙立则侧重于可重复印刷的polony gel的研发和制备，董润泽的工作重点是数据分析和算法。三个人的分工明确、配合完美，组内良好的氛围也让忙碌的科研生活平添了许多惬意。

　　原本按部就班地验证研究设想，谁也没料到别人会先发表。“当时挺难受的，也埋怨过为什么我们做得这么慢。那也是第一次让我特别受打击。”付笑男说。

　　“今年是我读博第四年，我有个很深的感触。做科研一开始的设想都很好，但中间会蹦出各种奇奇怪怪的问题，完全难以预料。我们只能‘遇山开山，遇水架桥’。”董润泽说。

　　在付笑男看来，任何一个研究，都必须要具备更超前的视野。即使你的研究跟别人有一点点重叠，但留一些后手，就可以做到心里不慌。你能想到第一步，可能别人也能，所以你最好要做到第二步甚至第三步。

　　对于这项研究的后续，付笑男又有了新的打算。“现在只是空间尺度，将来可以做时间尺度的研究，那会是下一个赛道，当然也会更加困难。”目前，他正在着手申请教职，准备组建自己的实验室，迎接新的困难和挑战。

　　而孙立也在有条不紊地筹备TopoGene公司，实现polony芯片的商业化，公司的组建已初见雏形。

　　还在读博士的董润泽也已经开始领导一个重大医学课题——将Pixel-seq应用于同时分析空间转录组与空间蛋白组，实现对人体组织中衰老细胞和相关标志物的准确检测。