流程化、更高效的基因编辑工具：打开肠道微生物组“窗口”

　　基因，就像是指挥官手里拿着的建筑总图纸，调控着生物体的一切生命活动。这份施工的图纸决定了整个建筑的所有呈现形式。那怎么才能对“图纸”——基因进行编辑呢？CRISPR/Cas编辑系统被认为是最佳的一种工具。

　　1月6日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所、深圳合成生物学创新研究院戴磊课题组在ACS Synthetic Biology上发表最新成果，研究团队开发了针对人体肠道拟杆菌的CRISPR/Cas编辑系统，可以对人体肠道拟杆菌的“图纸”进行修改，具有可进行流程化操作和无筛选标记、编辑效率高等特点。团队成员郑灵刚和谭扬为共同第一作者，戴磊为最后共同通讯作者。

　　“该方法突破了传统方法在编辑效率、基因簇删除和多基因编辑方面的瓶颈，为进一步理解肠道微生物组的功能以及活菌药物的开发奠定了技术基础。”戴磊表示。

　　让CRISPR/Cas“操刀” 打开肠道微生物组“窗口”

　　肠道拟杆菌属作为肠道中数量最高的细菌之一，被视为研究肠道微生物组的“窗口”，研究肠道拟杆菌可以为研究其他肠道微生物提供基础。此外，拟杆菌属细菌也与肥胖、炎症性肠病和结直肠癌等多种疾病相关。目前对于人体肠道菌拟杆菌属已有的基因遗传操作工具存在诸如流程复杂、编辑效率低等缺点，限制了进一步对肠道菌群和人体健康的研究。

　　如果可以进一步开发肠道拟杆菌的CRISPR/Cas编辑系统，将为研究其他肠道微生物打通“道路”，也为治疗人类多种疾病提供更多可能性。为了获得简便、高效的遗传操作工具，研究团队设计了基于CRISPR/Cas的编辑系统，可以根据研究者的需要，构建无筛选标记的拟杆菌突变株。

　　那么“操刀”师傅CRISPR/Cas是如何流程化操作的呢？

　　首先，研究人员使用穿梭质粒作为“马车” ，让其携带“涂改”工具（剪刀和修复画笔，即Cas基因和修复模板）进入细菌内部。在接收到需要涂改的命令（加入诱导剂）后，Cas基因将表达出来的Cas蛋白作为“剪刀”，剪开gRNA靶向的基因位置，完成对目标片段的删除。其次，在有修复模板（修复画笔）存在时，随即可将修复模板通过同源重组的方式插入到目标位置，完成基因的插入。最后，通过在培养基中传代，从而实现获得无筛选标记的拟杆菌突变株。利用此方法，可流程化地获得肠道工程菌，为未来活菌药物的设计与构建提供新的工具。

　　CRISPR/Cas编辑示意图 来源：科研团队供图

　　高效、多功能的基因组编辑工具

　　拟杆菌属的传统编辑工具的效率为4%-25%之间，该研究团队通过利用CRISPR/Cas系统，使其编辑效率可以达到80%-100%。这将极大地促进对肠道菌群和人体健康的基础和应用研究。

　　“马车”、“剪刀”等工具在此过程中都起着举足轻重的作用，该团队在拟杆菌属中测试了不同的CRISPR/Cas系统。发现使用诱导型启动子表达FnCas12a蛋白（剪刀），可以实现高效的基因编辑。基于此，团队测试该系统在多形拟杆菌中可以实现大片段的删除和外源基因的高效插入。

　　“外源基因GFP是一个荧光蛋白，若能成功插入到基因组中，即可观察到菌体发出绿色荧光，供我们查看‘涂改’成功与否。”戴磊表示。

　　基因簇的删除和外源基因的插入 来源：科研团队供图

　　此外，该系统也成功在卵形拟杆菌、脆弱拟杆菌、普通拟杆菌、单形拟杆菌等多个物种中实现高效率的基因编辑。

　　高效、精准的基因组编辑方法对于解析肠道微生物组的功能、开发工程肠道益生菌都是不可或缺的工具。与之前针对拟杆菌属基因基因遗传操作工具相比，该团队基于CRISPR/Cas系统的工具极大的提高了基因编辑的效率，同时也更容易实现无筛选标记突变株的获得。戴磊表示，未来，该技术将推动肠道菌群与人体健康的机制研究，有望实现重大慢性疾病的预防和治疗。