mESCs二倍体胚胎嵌合

实验概要

mESCs二倍体胚胎嵌合

主要试剂

孕马血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG）、H-CZB、人绒毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，hCG）

实验材料

注射器、手术剪、手术镊、35 mm培养皿、15 mL离心管、持卵针、体视显微镜、显微操作仪、电融合仪

实验步骤

（1）制备假孕鼠
下午挑取自然发情雌鼠，与结扎雄鼠合笼交配；在第二天检阴栓，检出阴栓的雌鼠记为交配后0.5 dpc，2.5 dpc假孕鼠的子宫就可以用做受体，进行胚胎移植。
（2）胚胎准备
①超数排卵【在动物发情的适当时期，利用外源促性腺激素类药物调节雌性动物体内的激素水平，促进卵巢的多个卵泡发育，并能排出超过正常数量的卵子的方法，称为促排卵，也称超数排卵，简称“超排”】。选取8～12周龄的雌性小鼠，约5：00 PM注射PMSG（10U/只），48小时后注射hCG（10U/只）。
②雌雄小鼠合笼：将超数排卵的雌鼠与雄鼠合笼，第二天早上检查阴栓，检出有阴栓的雌鼠记为0.5 dpc，继续饲养，3天后至3.5 dpc。
③冲胚：断颈处死雌鼠，取完整子宫部分，用吸满H-CZB的钝针头冲子宫内腔，将冲出来的囊胚收集起来，放于CZB中培养，待用。
（3）显微操作
用持卵针固定好二倍体囊胚，固定靠近ICM部分，使ICM部分大约固定在9点钟位置上。用平口注射针吸取约10个供体细胞，从约3点钟位置进针，抵住受体囊胚透明带以及滋养层细胞与细胞间的连接处，用Piezo给电脉冲（100 V/mm，50 μs），使注射针进入囊胚腔，将供体细胞吹到靠近ICM的囊胚腔中。
（4）胚胎移植
①显微操作完成的胚胎，放在含葡萄糖的CZB培养液中培养1～2 h，待囊胚腔重新膨胀起来后进行胚胎移植。
②将2.5 dpc假孕鼠麻醉后，进行手术，将扩展的囊胚移入子宫角内，每侧子宫移植10～12个胚胎。
③手术后的小鼠送回鼠房饲养，待17天后，即假孕鼠的19.5 dpc观察嵌合鼠的出生结果。mESCs二倍体嵌合动物（供体细胞来自于C57BL/6品系，受体胚胎来自于ICR品系）如图3-8所示，黑色与白色嵌合的小鼠为二倍体嵌合鼠。
！注意：显微注射必须在细胞准备后的2 h内完成，推迟显微注射太长时间会严重影响二倍体嵌合的效率。