mESCs冻存及复苏

实验概要

mESCs冻存及复苏

主要试剂

mESCs培养液A 或者B、冻存液A、DPBS、0.25%Trypsin、细胞基础培养液

实验材料

15 mL离心管、冻存管、程序降温盒、镊子、培养皿

实验步骤

（1）冻存
①冻存细胞时，最好提前两个小时更换新鲜的培养液。
②准备冻存液并放到冰上预冷。
③弃去培养液，用DPBS洗一遍细胞。
④弃去DPBS后用0.25%Trypsin消化至胚胎干细胞克隆的细胞边缘清晰，立即用等体积的细胞基础培养液终止。
⑤轻轻地把细胞吹打成单个细胞，收集细胞悬液至15 mL离心管，室温1000 r/min离心5 min。
⑥弃去上清，加上冻存液混匀，使细胞的浓度为2×10⁶～5×10⁶细胞/mL，之后按0.5～1 mL/管分装到冻存管，一般来说每个冻存管内的细胞可以复苏到一个35 mm培养皿中。
⑦记录细胞名称、冻存时间、冻存代次、品系、复苏剂量、冻存人等信息。按分步法或程序降温法冻存细胞。
（2）复苏
①提前一天准备好饲养层细胞，同mESCs传代第（1）步。
②将5 mL细胞基础培养液加入15 mL离心管中培养液。
③从液氮中取出细胞冻存管，放到37℃水浴中使细胞悬液迅速融化，可以用镊子来回晃动冻存管加速融化。
④把融化的细胞悬液加到第②步准备的离心管中，室温1000 r/min离心5 min。
⑤去上清，用mESCs培养液悬浮细胞后接种到事先准备好的饲养层细胞上，37℃、5% CO₂培养。
⑥每天更换新鲜mESCs培养液。