mESCs四倍体胚胎嵌合

实验概要

mESCs四倍体胚胎嵌合

主要试剂

PMSG、H-CZB、hCG、电融合液、CZB培养液、含葡萄糖的CZB培养液

实验材料

注射器、手术剪、手术镊、35 mm培养皿、15 mL离心管、持卵针、体视显微镜、显微操作仪、电融合仪

实验步骤

（1）二倍体二细胞期胚胎准备
①超数排卵。采用8～12周龄的雌性小鼠，约5：00 PM注射PMSG（10 U/只）；48 h后注射hCG（10 U/只）。
②雌雄小鼠合笼：将注射超排的雌鼠与雄鼠合笼；第二天早上检查阴栓，检出有阴栓的雌鼠记为0.5 dpc。
③冲胚：处死1.5 dpc见栓雌鼠，剪取完整输卵管部分，用装有H-CZB的钝针头插入输卵管的伞口部分，用H-CZB冲输卵管，然后收集受精二细胞胚胎，将收集好的二细胞胚胎在CZB培养液中培养15-30 min。
（2）电融合
电融合仪采用Eppendorf公司产品（Multiporator），电融合模式设为II型。
①将受精二细胞胚胎用电融合液清洗至少3遍，然后将二细胞期胚胎依次排列在电融合槽的两个电极之间，每次约排列15～20个胚胎，点击【开始】按钮后，完成电融合过程。
②将进行电融合操作后的胚胎用H-CZB清洗至少3遍以上，放入CZB培养液中培养。用过的电融合槽要用蒸馏水清理5遍以上。
③电融合结束后1 h观察融合结果；将融合的一细胞胚胎继续培养；48～54 h后，融合胚胎即可发育成四倍体囊胚，用于四倍体补偿操作。
（3）假孕鼠准备
挑取自然发情雌鼠，与结扎雄鼠合笼交配。在第二天检阴栓，检出阴栓的雌鼠记为0.5 dpc；继续饲养至2.5 dpc，就可以用做受体，进行胚胎移植。
（4）显微操作
用持卵针固定好四倍体囊胚，吸取靠近ICM部分，使ICM部分固定在大约9点钟位置上；用平口注射针吸取约10～15个供体细胞，从3点位置进针，抵住囊胚透明带及滋养层细胞与细胞间的连接处，用Piezo给电脉冲，使注射针进入囊胚腔，将供体细胞吹至靠近ICM的囊胚腔中。
（5）胚胎移植
①显微操作完成的胚胎，放在含葡萄糖的CZB培养液中，继续培养1～2 h后进行胚胎移植。
②将2.5 dpc假孕鼠麻醉后，进行手术，将胚胎移入子宫角内，每侧子宫移植10～12个胚胎。
③手术后的小鼠继续饲养，17天后，19.5 dpc假孕鼠可以等其自然生产或进行剖腹产。
④处死假孕鼠(代孕雌鼠) ，进行解剖，获得四倍体嵌合胎儿，记录并统计出生率、着床点等重要数据。
（mESCs来源的四倍体动物如图3-9所示，四倍体补偿获得的动物除胎盘之外所有组织器官均来自于注射的细胞，因此小鼠的毛色与注射细胞的品系是一致的）。
！注意：显微注射必须在细胞准备后的2 h内完成，推迟显微注射太长时间会严重影响四倍体嵌合产生四倍体小鼠的效率。