mRNA的分离和纯化实验（一）

实验原理

从细胞或组织中得到RNA是一种混合物，其中包括tRNA，rRNA和mRNA，其中RNA为75％～ 85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA基因序列不同，分子量大小不均一，各基因的表达丰度也不一样。每克细胞可分离出5-10mg RNA。

真核生物mRNA具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴。绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20-300个腺苷酸组成的poly（A）尾，这种结构为真核mRNA分子的分离和纯化，提供了极为方便的条件，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的实验理论就在于此。

一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’端含有poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过oligo(dT)纤维素柱吸附和解吸附，即可得到较纯的mRNA。

实验材料

1、0.1mol/L NaOH （用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置）

2、寡聚Oligo（dT）-纤维素

3、加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。（用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置）

4、洗涤缓冲液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。（用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置）

5、5 mol/L NaCl（加0.1% DEPC处理过夜）

6、3 mol/L NaAc pH5.2（加0.1% DEPC处理过夜）

7、无RNase双蒸水(DEPC水)

8、70%乙醇（用0.1% DEPC处理过的无RNase水配置）

需要用到的实验仪器：恒温水浴箱，高速冷冻离心机，紫外分光光度计，巴斯德吸管，玻璃棉，5ml一次性注射器。

实验过程

（一） oligo(dT)纤维素的预处理

1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

2、将悬浮液装入填有经DEPC水处理，高压灭菌后的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床约0.5-1.0mL，用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。

3、用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素，直到流出液的pH值小于8.0。

4、将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出，用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮，浓度约为0.1g/mL，保存在4℃待用。

（二） 总RNA浓度的调整

1、把总RNA液转到适合的无RNase离心管中，测定总RNA的浓度。如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL，则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL，总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。浓度调整以后，把RNA溶液置于65℃水浴加热5 min，然后迅速插在冰上冷却。

2、加入一定体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L。