mRNA差别显示技术[DDRTPCR]

随着PCR技术的发展，人们在此基础上建立起了一系列基于基因分离的新技术新方法。如mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、以及进一步改进的代表性差示分析（RAD），抑制性扣除杂交（SSH）和交互扣除RNA差别显示技术（RSDD）。

差别显示ＰＣＲ是根据绝大多数真核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的 mRNA反转录成cDNA。该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游引物，称3′-锚定引物，其通式为5’-T11MN；同时为扩增出polyA 上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20000条左右的 DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。

差别显示技术自1992年建立后，一直在不断进行着改进。如在1994年，Ito等对3′端锚定引物的设计由固定两个碱基变为一个碱基固定的引物，这就使原来12种引物减至3种即可(5′Ｔ12Ｇ，5′Ｔ12Ａ，5′Ｔ12Ｃ)，这样做减少了每个mRNA样品对逆转录反应种类的需要，并且把由于简并性引起的某些ＲＮＡ的代表性差和RNA数量过多现象降低到最低程度；在随后的两年中，研究人员有在3′端引物和5′随机引物末端分别加上了限制性内切酶识别位点 (如Hind III酶切位点)，使得5′端引物条数改为8条，长度为13bp，而3′端引物则由18个碱基组成。这样形成的24种引物对，经计算机同源性分析表明同样能覆盖全部mRNA，使实验简化，同时由于引物变长，使cDNA扩增更为有效。有的实验室采用把Bakman公司的kit，其引物5′端为26bp，3′ 端为31bp，并加上了T3和T7两端的测序引物，由仪器切割差异条带后，再次扩增，并通过荧光标记，用计算机统计出结果。此外，许多学者针对该技术在****作中假阳性高等问题，还从设计对照、提取胞质RNA、更换放射性标记物以及改变PCR反应条件等等方面提出了相应解决方案，以求这一技术得到进一步完善。

DD-PCR与示差筛选、扣除杂交相比,具有很多优点:

1)速度快,较易操作;

2)由于 PCR扩增技术的应用,使得低丰度mRNA的鉴定成为可能,且灵敏度高;

3)可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。

尽管差别显示技术有以上诸多方面的优点,但在实际操作中仍存在一些问题,主要表现在:

1)出现差别条带太多,假阳性率高达70%左右,重复性差,且对高拷贝数的mRNA具很强的倾向性;

2)扩增条带分子长度较短,一般在110～450bp之间。