mRNA的提取及纯化实验

mRNA

mRNA分离试剂盒 异丙醇 NaAC

仪器 水浴 离心机 取液器 分光光度计

一、生物素标记的Oligo（dT）探针与mRNA的煺火

1.  在DEPC处理过的1.5 ml Eppendof管中，加入0.2-1 mg 的总RNA和无RNase的水至终体积为0.5 ml。

2.  65℃加热10 min。

3.  加入2 μl 生物素标记的Oligo（dT）探针和12 μl 的20×SSC于RNA中轻轻混匀，室温放置，逐渐冷却平衡至室温，此步操作一般需10 min。

二、亲和素顺磁磁珠（SA-PMPS）的冲洗

1.  将SA-PMPS轻晃开后，放入磁性分离架中，使SA-PMPS集中于试管一则（约30秒）， 小心去除上清（不用离心方法）用1.5 ml 0.5×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠， 去除上清，漂洗3次。

2.  将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2 ml 0.5×SSC中。 杂交体的生成及漂洗。

3.  将上步“3”中褪火的生物素标记的Oligo（dT）探针，全部加到上步“5”管中，轻轻混匀，室温放置10 min。每隔2分钟轻轻混匀一次。

4.  用磁性分离架捕获磁珠，吸弃上清。

5.  用0.3 ml 0.1×SSC漂洗SA-PMPS，用磁性分离架集中磁珠，吸弃上清，漂洗4次。

三、洗涤收集mRNA

1.  将漂洗过的SA-PMPS重新悬浮于0.2 ml DEPC水中。

2.  用磁性分离架捕获磁珠，将洗脱的水相吸至一新管中。重复洗涤一次，吸取水相，两次水相合并（约0.25 ml）

3.  在洗脱液中加入0.1体积的NaAC，1体积的异丙醇，-20℃沉淀过夜，12 000 g 离心10 min，75%乙醇洗沉淀，真空干燥。

4.  提取mRNA质量的分光光度计检测，将所提mRAN分别在260，280 nm 比色，要求A.  OD260%/ OD280%不小于2.0及40 μg 所提样品在OD260%的值为1 。

5.  提取mRNA质量的电泳检测，在1%的变性胶上，EB染色后，mRNA应在0.5-8 Kb 间均匀着色，1.5-2 Kb 间着色较强。