mRNA的分离实验

1.  用0.1 mol/L NaOH悬浮0.5～1.0 goligo（dT）-纤维素。
 
2.  将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5～1.0 ml，用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1 ml的oligo（dT）-纤维素最大量为10 mg总RNA，如果总RNA的量较少，则应减少oligo（dT）-纤维素的使用量，以防止poly（A）+RNA在过柱以及后续步骤中损失。
 
3.  用无菌的1×层析柱加样缓冲液冲洗柱床，直至流出液的 pH 值小于8.0。1×层析柱加样缓冲液为：20 mmol/L Tris-  HCl（pH7.6），0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA（pH8.0），0.1%SDS。
 
可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液：将适量无RNA酶的Tris-HCl（pH7.6）、氯化钠和EDTA贮存液混合在15 lbf/in2（1.034×105 Pa）高压下蒸汽灭菌，待其冷却至65 ℃左右时加入已在65 ℃预热30 min的10%SDS贮存液。也可以用0.05 mol/L柠檬酸钠代替Tris- HCl，然后用DEPC处理柠檬酸钠-NaCl-EDTA和SDS的混合溶液。
 
4.  用灭菌水溶解RNA，于65 ℃温育5 min后迅速冷却至室温，加等体积的2×层析柱加样缓冲液，上样，立即用灭菌的试管收集洗液。当所有的RNA溶液均进入柱床后，加1倍体积的1×层析柱加样缓冲液，继续收集洗出液。加热RNA可以破坏poly（A）尾的二级结构。
 
5.  当全部溶液流出后，将收集液置于65 ℃温育5 min，重新上样，并收集流出液。
 
6.  用5～10倍柱床体积的1×层析柱加样缓冲液洗柱，分部收集洗出液，测定每一收集管的OD 260。最后由于不带poly（A）的RNA洗过柱床，OD260会很高，后来OD260值则很小或为零。在某些方案中，上述步骤后还用5倍柱体积的含0.1 mol/L NaCl的1×层析柱加样缓冲液洗柱床，然而由于洗出的不带poly（A）的RNA很少甚至没有，因此这一步骤可以省略。
 
7.  用2～3倍柱床体积的经灭菌且无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱mRNA，以1/3～1/2柱床体积分部收集洗脱液。洗脱缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH7.6），1 mmol/L EDTA（pH8.0），0.05%SDS。
 
用于配制洗脱缓冲液的Tris-HCl和EDTA贮存液应为新近高压处理的溶液，可用适量的灭菌水稀释上述贮存液配制洗脱缓冲液。洗脱缓冲液不能高压处理，因高压处理会使溶液产生大量气泡。
 
8.  收集液置于透明的小容器内，测定OD260，使用前比色杯须用浓盐酸-甲醇（1∶1）浸泡1 h，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗，合并含有RNA的洗脱组分。经上述一轮oligo（dT）-纤维素亲和量层析后得到的RNA中，带与不带poly（A）RNA，其含量近乎相等。如欲进一步纯化mRNA，可将洗脱液于65 ℃温育3 min，迅速冷却至室温，加入NaCl至终浓度为0.5 mol/L，用同一oligo（dT）-纤维素柱进行第二轮层析。
 
9.  收集oligo（dT）-纤维素柱层析的洗脱液，在mRNA溶液中加入3  mol/L乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3 mol/L，混匀。加2.5倍体积用冰预冷的乙醇，混匀，冰浴至少30 min。
 
10.  于4 ℃以10000×g离心15 min，回收poly（A）+RNA，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀（通常看不见沉淀），离心片刻，在空气中晾干核酸沉淀。
 
11.  用少量水重溶RNA，置于比色杯内，测定OD260，使用前比色杯须用浓盐酸-甲醇（1∶1）浸泡1   h，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗。
 
12.  将mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯离心管内，加3倍体积乙醇，混匀，于-70 ℃保存备用。回收RNA时，只需取出一小份贮存液，加3 mol/L乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3 mol/L，混匀，用微量离心机于4 ℃以12000×g离心5 min即可。

1.  OD260=1的溶液其RNA含量约为40 μg/ml。
 
2.  从107个哺乳动物培养细胞中可获得1～5 μgmRNA，所得mRNA通常只占上柱的总RNA的1%～2%。
 
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