mRNA的细胞内注射实验

一、用于细胞内注射的加帽 mRNA 的制备

材料

步骤

1.依次加入下列物质，终体积为 20ul，冰上操作：

2.37℃ 温育 lh。

3.加入 Iul DNA 酶 I(无 RNA 酶)，37℃ 温育 10 min。

4.用 RNaid 试剂盒提纯 mRNA。

5.25ul 灭菌水（无 RNA 酶）溶解 RNA。

二、注射的准备

材料

溶液

(未提到的溶液，可以参见方法 1「培养神经元的原位杂交」相关部分)

步骤

1.从中枢神经系统分离神经元，保持其一长段轴突的完整。

2.在条件培养基中培养 i8~48 h, 直到从原有的轴突长出足够的突起。

3.用锋利的玻璃电极，从距离胞体大约一个细胞直径的部位横切轴突。

4.用微量加样器给玻璃电极充灌 mRNA(质量浓度 2 〇?50ng/pd)。仅使电极头部充满 mRNA 溶液（每个电极大约用 0.3ul)。

5.穿刺轴突，以 20psi、持续 1~15S 脉冲将 mRNA 注射入轴突。在相差显微镜下可观察到白色小滴状的 mRNA。

6.温育。温育时间根据细胞类型和所用 mRNA 种类而定。在我们的实验中，应用椎实螺属编码卵生激素前体的 mRNA,—般注射后温育 2 h 可以检测到其转化的蛋白。

7.固定并透膜处理细胞，按培养神经元:ISH 方法中第 1-3 步进行。

8.TBSGT 洗涤 2 次，每次 5 min。

9.与一抗温育、室温 2 h 或 4℃ 过夜。

10.TBSGT 洗涤 2 次，每次 10 min。

11.与二抗温育，室温 1~2 h。我们的实验应用 FITC 交联的二抗，也可用酶交联抗体。用碱性磷酸酶交联二抗的步骤可参见方法 i「培养神经元的原位杂交’

12.TBSGT 缓冲液洗涤丄次，5 min.

13.水洗涤 2 次，每次 I0 min。

14.75% 甘油（溶于水）封片，甘油溶液中含 0.5% 乙二胺，以减慢 FITC 的褪色。

15.倒置荧光显微镜观察。

三、结果

为研究离体轴突中的 mRNA 是否能转化成蛋白质，我们将编码卵生激素（ELH) 前体的 mRNA 注入 PedalA 细胞的轴突。我们首先证实这些细胞不表达 ELH 基因。然后通过免疫细胞化学方法用 ELH 的抗血清检测注射 mRNA 的翻译。结果显示，离体轴突能够将注射的 mRNA 转化成通过免疫细胞化学方法可检测到的蛋白质。转化产物主要定位于生长锥和曲张体（图 3-7)。