mRNA的PCR差异显示实验

人的细胞总 RNA 或 poly（A）＋ RNA

人胎盘 RNase 抑制剂 DNase I Tris·Cl KCl MgCl2 3：1 （V V） 苯酚 氯仿 乙酸钠 乙醇 DEPC 处理的水 简并锚定 oligo（dT） 引物组合 MoMuLV 逆转录酶缓冲液 DTT 4dNTP 混合物 MoMuLV 逆转录酶 PCR 扩增缓冲液 ［α-33P］ dATP 随机十聚体 Taq DNA 聚合酶 矿物油 甲酰胺上样缓冲液 糖原（无 DNase）

65℃、95℃、80℃ 和 100℃ 水浴 热循环仪 Whatman 3 MM 滤纸

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1. 消化细胞总 RNA 或 poly（A）^＋ RNA 中的 DNA：

50 ug RNA

10 ul 1 U/ul 人胎盘 RNase 抑制剂

1 /ul 10 U/ul 无 RNase 的 DNase I

5 ul 0.1 mol/L Tris·Cl，pH 8.3

5 ul 0.5 mol/L KCl

5 ul 15 mmol/L MgCl₂

加水到 50 ul

37℃ 温育 30 min。

2. 加入 50 ul 酚/氯仿（3：1），涡旋混勻，最高速离心 2 min 分相。

3. 转移上层到一个干净的微量离心管中，加入 5 ul 3 mol/L 的乙酸铵和 200 ul 100％ 乙 醇。-70℃ 放置 30 min 沉淀 RNA。

4. 高速离心 10 min。去除上清，用 500 ul 70％ 的乙醇洗涤沉淀（沉淀的 RNA）。

5. 溶解 RNA 沉淀于 20 ul DEPC 处理水，用分光光度计测量 A₂₆₀ 准确定量 RNA 的浓度。

6. 用琼脂糖/甲醛凝胶电泳分析 3 ug 用作差异显示分析的 RNA，检査 RNA 的完整性。无 DNA 的 RNA 保存在 -80℃ 直到做差异显示分析。

7. 对于每一个 RNA 样品，标记 4 个微量离心管为 G、A、T 和 C 个管子对应一个简并锚定 oligo （dT） 引物。

8. 把 1 ug 无 DNA 的 RNA （步骤 5）稀释到 0.1 ug/ul， 置于冰上。

9. 用 4 个不同的简并锚定引物（5'-T₁₂MN-3'；T₁₂MG、T₁₂MA、T₁₂MT、T₁₂MC，M 是 G、A 或 C） 配制无 DNA 的总 RNA 或 poly （A）^＋ RNA 的逆转录反应：

4 ul 5×MoMuLV 逆转录酶缓冲液（终浓度 1×）

2 ul 0.1 mol/L DTT （终浓度 10 mmol/L）

1.6 ul 250 umol/L 4dNTP 混合物（终浓度 250 mmol/L）

0.2 ug 总 RNA 或 0.1 ug poly （A）^＋ RNA

2 ul 一个 10 umol/L 简并锚定 oligo（dT） 引物（T₁₂MN； 终浓度 1 umol/L）

DEPC 处理水调整体积到 19 ul。

10. 65℃ 温育 5 min 变性 mRNA 的二级结构，继续 37℃ 温育 10 min 复性引物。

11. 每管加入 1 ul 200 U/ul 的 MoMuLV 逆转录酶，混匀，37℃ 温育 50 min。

12. 95℃ 加热 5 min，灭活逆转录酶，高速离心把溶液收集到管底。把管子放在冰上马上准备 PCR，或保存在 -20℃ 以备日后使用（可以稳定保存至少 6 个月）。

13. 为每个引物准备如下 20 ul 的反应混合液：

10 ul H₂O

2 ul 10× 扩增缓冲液（终浓度 1×）

1.6 ul 25 umol/L 4dNTP 混合物（终浓度 2 umol/L）

0.2 ul ［α-³³P］ dATP

2 ul 12 umol/L 的随机十聚体（终浓度 0.2 umol/L）

2 ul 10 umol/L 的简并锚定 oligo（dT） 引物（T₁₂MN； 终浓度 1 mmol/L）

2 ul cDNA （12 步）

0.25 U 5 U/ul Taq DNA 聚合酶

14. 上下吹吸混勻，覆盖 25 ml 矿物油。

15. 在热循环仪上用如下程序扩增：

40 轮：

30 s 94℃ （变性）

2 min 40℃ （复性）

30 s 72℃ （延伸）

1 轮：

5 min 72℃ （延伸）

最后一步：4 C （保持）

16. 混合 3.5 ul PCR 产物和 2 ul 甲酰胺上样缓冲液，80℃ 加热 2 min。上样到 6％ 的变性聚丙烯酰胺凝胶上。60W 电泳约 3 h 直到二甲苯青走到离底部 10 cm 以内。

17. 小心移去凝胶上的一块玻璃板。把一张 Whatman 3 MM 滤纸覆盖在凝胶上，在凝胶和滤纸之间不要留有气泡。不需要在甲醇/乙酸中固定，室温干凝胶约 1 h。

18. 使用放射性墨水或钟头打孔器标记 X 射线胶片和干好的凝胶移确定它们的方向。室温曝光 24～48 h。

19. 洗片，把凝胶片和凝胶比照，标出感兴趣的 DNA 条带（在不同泳道差异显示的条带）或用一支干净的铅笔或割穿凝胶片在凝胶片下作标记。

20. 用刀片割出凝胶块和黏附其上的 Whatman 3 MM 滤纸，放人一个微量离心管。加入 100 ul H₂O， 室温浸泡 10 min。

21. 盖上管子煮沸 15 min。

22. 高速离心两分钟沉淀凝胶块和滤纸残渣。转移上清到一个干净的管子里。

23. 上清中加入 10 ul 3 mol/L 的乙酸钠（终浓度 0.3 mol/L） 和 5 ul 10 mg/ml 的糖原 （作为载体）。加入 400 ul 100％ 的乙醇，-70℃ 放置 30 min。4℃ 高速离心 10 min。

24. 用 500 ul 85％ 的乙醇洗涤沉淀，晾干，重新溶解于 10 ul H₂O 中。

25. 在一个 40 ul 的反应体积里再次扩增 4 ul 洗脱的 DNA。使用和步骤 13～15 中同样的简并描定引物和 PCR 条件，不同的是加入 250 umol/L 4dNTP 混合物（终浓度 20 umol/L） 代替 1.6 ul 25 umol/L 4dNTP 混合物，也不加同位素。-20℃ 保存剩余的回收 DNA 以备将来扩增（可稳定数年）。

26. 取每个 PCR 样品 30 ul 在 1.5％ 的琼脂糖凝胶上电泳，用 0.5 ug/ml 的 EB 染色。20℃ 保存剩余的 PCR 样品（可以稳定保存数年）。

27. 从琼脂糖凝胶上抽提所希望扩增的 DNA 条带。用它作探针进行 North-era 印迹分析和 cDNA 库的筛选。

28. 亚克隆，测序鉴定余下的 PCR 样品。

必须由受过正确使用 ³³P 同位素的人员在经 NRC 认证的地方进行。防止过量的照射，必须始终贯彻人员和仪器的同位素污染防范标准。

1. 材料

人的细胞总 RNA 或 poly （A）^＋ RNA

2. 试剂

1 U/ul 人胎盘 RNase 抑制剂

10 U/ul DNase I （无 RNase）

0.1 mol/L Tris·Cl，pH 8.3

0.5 mol/L KCl

15 mmol/L MgCl₂

3：1 （V/V） 苯酚/氯仿

3 mol/L 乙酸钠，pH 5.2

100％、70％ 和 85％ 的乙醇

DEPC 处理的水

浓度各为 10 umol/L 的简并锚定 oligo（dT） 引物组合 （如 Genhunter）： T₁₂MG、T₁₂MA、T₁₂MT， T₁₂MC （M 代表 G、A 或 C）

5 × MoMuLV 逆转录酶缓冲液

0.1 mol/L DTT

250 umol/L 和 25 umol/L 的 4dNTP 混合物

200 U/ul 的 Moloney 鼠白血病病毒（MoMuLV） 逆转录酶

10× PCR 扩增缓冲液（使用 15 mmol/L MgCl₂， 0.1 mg/ml 白明凝胶；保存在 -20℃）

10 uCi/ul ［α-³³P］ dATP（＞2000 Ci/mmol）

2 umol/L 随机十聚体（如 GenHunter 或 Operon Technologies）

5 U/ul Taq DNA 聚合酶

矿物油

甲酰胺上样缓冲液

10 mg/ml 的糖原（无 DNase）

3. 耗材

65℃、95℃、80℃ 和 100℃ 水浴

热循环仪

Whatman 3 MM 滤