miRNA与癌症：了解它们之间的关联

　　在肿瘤发生的经典模型中，癌症通过慢慢积累突变、放任细胞增长而发生。许多这样的突变影响关键的调控蛋白，如原癌基因和抑癌基因。不过，非编码RNA基因的突变也同样有害，尤其是microRNA。

　　microRNA（miRNA）是一类22个核苷酸的调控转录本。它们与mRNA靶点相结合，或抑制其翻译，或诱导其降解。因此，它们也像转录因子一样，影响基因表达。

　　根据Brigham妇女医院的Sean Lawler在2014年发表的综述，第一个将miRNA与癌症相关联的线索发表于2002年，研究发现慢性淋巴细胞白血病中的miR-15和miR -16缺失，导致它们的靶点BCL2上调。自那时起，人们开始研究miRNA在癌症中的作用。

　　如今，研究人员已经鉴定出数千个miRNA，并积极研究它们的生物学，以及它们是否能作为疾病、预后或治疗反应的生物标志物。各种各样的工具也应运而生，协助研究人员更好地了解miRNA的作用。

　　模拟物和抑制剂

　　大多数的miRNA工具分成两大类：miRNA操控和miRNA表达分析。

　　操控这一类主要是miRNA模拟物、抑制剂和表达构建体。模拟物和抑制剂是合成分子，顾名思义，模拟miRNA的表达或阻断它们的调控能力。表达构建体让研究人员能通过一个或多个miRNA基因的转录，在靶细胞上施加长期影响。

　　Dharmacon（现属于GE Healthcare）提供模拟物和抑制剂；这些可通过转染导入细胞。据Dharmacon研发主管Melissa Kelley介绍，研究人员可以在相同条件下、不同的孔中使用模拟物和抑制剂，寻找相反的表型，以便对结果更加自信。

　　Dharmacon也提供慢病毒表达的模拟物，称为shMIMIC lentiviral microRNA，用于那些无法轻易转染或需要长期活性的细胞。据Kelley介绍，shMIMIC lentiviral microRNA是短的发夹结构，在细胞中表达并被处理成成熟的miRNA，以验证表达特定的miRNA是否能让细胞恢复正常生长。

　　表达工具

　　与所有RNA一样，研究人员也可以利用新一代测序（NGS）、芯片、qPCR和原位杂交等方法来定量miRNA。

　　NGS和芯片撒下了一张最大的网，特别适合探索性的研究，比如确定耐药性的转录特征。这两种方法都带来了全基因组的覆盖度，不过NGS是无假说的，赛默飞世尔科技的TaqMan产品经理Sara Brown如是说。“你可以鉴定之前不知道的新miRNA，但缺点在于流程和价格，以及生物信息学。”

　　Affymetrix的肿瘤产品销售主管Guy Afseth 则表示，qPCR提供了低成本、灵敏度和通量的优势，特别适合在大量样品中验证候选的miRNA，而ISH让研究人员能够在形态背景下定量转录本。

　　Affymetrix（现属于赛默飞世尔）提供了两方面的产品，包括GeneChip芯片，以及原位杂交检测（ViewRNA miRNA ISH Cell Assay），能够同时荧光定量1个miRNA和2个mRNA目标。

　　ViewRNA检测是基于支链DNA杂交方案，将信号强度扩大了8000倍。据Afseth介绍，miRNA的检测方案与其他转录本是相同的，不过由于miRNA很短，探针设置上就缺乏灵活性，这也意味着灵敏度和特异性可能受到影响。

　　据Affymetrix表达业务部门的销售主管Johanne McGregor介绍，他们目前的miRNA芯片设计（4.0版，基于miRBase 20）不仅包含了miRBase数据库中每个转录本的探针，也包含了其他一些短的非编码RNA的探针，如snoRNA和scaRNA，“让研究人员能更广 泛地探索非编码RNA世界”。通过该公司的MyGeneChip™定制芯片项目也可获得定制芯片。

　　赛默飞世尔为miRNA检测提供了两种类型的qPCR分析。第一代的TaqMan检测利用miRNA特异的 茎环结构引物来形成miRNA转录本的DNA拷贝。Brown认为，这在特异性上具有优势，但合成的cDNA不能用于其他miRNA的分析，对于珍贵的临 床样本而言，这是个问题。

　　最近，这家公司推出了基于通用引物的第二代策略，扩增样品中的所有miRNA，即使是那些还未被发现的miRNA。“你只要保存好cDNA，它可用于未来任何miRNA的研究，”Brown说。

　　如果你想要直接定量体液中的miRNA，那么Abcam的Firefly检测适合你。据Abcam的经理Dan Pregibon介绍，Firefly依赖一系列棒状的水凝胶微粒。每个微粒都带有条形码，可识别特定的miRNA；一个样品中最多可混合70个条形码。

　　具体过程是，将样品与多个Firefly微粒混合，每个微粒捕获与其互补的miRNA。那些miRNA经过 生物素化引物的扩增，再次被微粒捕获，并标上链霉亲和素结合的荧光基团。最后，在流式细胞仪分析微粒，以确定miRNA的种类和丰度。目前，Abcam提 供5种预制的Firefly试剂盒，也提供定制产品。

　　更好的癌症诊断

　　所有这些工具期望的结果，当然是新的生物标志物和疗法，改变癌症诊断和治疗的过程。截至2014年，至少有 20项基于miRNA的临床试验在进行中。不过McGregor认为，miRNA仅仅代表了一类非编码RNA，其他种类的miRNA也发挥了关键的调控作 用。“lncRNA、piwiRNA、tRNA – 整个非编码RNA的世界无疑是值得关注的，”她说。