实验概要
monESCs传代、冻存及复苏
主要试剂
DMEM/F12培养液、monESCs培养液、冻存液C、1 mg/mL胶原酶Ⅳ
主要设备
15 mL离心管，5 mL、10 mL移液管，冻存管、6孔培养板、倒置显微镜
实验步骤
传代前一天首先准备好MEF饲养层细胞，饲养层细胞要求密度为1.2×104～1.5×104 cells/cm2，切忌密度过高
①传代之前首先在37℃水浴锅中预热Ⅳ型胶原酶、DMEM/F12培养液和monESCs培养液。
②传代时首先吸弃旧的培养液上清，然后用DMEM/F12培养液轻轻冲洗一遍，之后加入1mg/mL的Ⅳ型胶原酶，放在培养箱中消化10min左右，消化过程中在显微镜下注意观察消化的效果，当克隆边缘卷起时可以终止消化，直接弃掉酶，加入新鲜的DMEM/F12培养液洗一遍。
！注意：monESCs的消化时间和其状态以及胶原酶Ⅳ的储存时间相关，新鲜配制的酶一般作用较快。
③再次加入DMEM/F12培养液1 mL/孔，用2 mL移液管头轻划仍然在皿底附着的ES克隆，并用移液管轻柔吹吸几次，此时将获得含有小克隆团块的monESCs悬液。
④将细胞悬液转移到15 mL的离心管中，室温800 r/min离心2 min。
⑤离心结束后，弃掉上清，用适量的monESCs培养液重悬离心后的细胞，将其接种到新的饲养层细胞上。
!注意：一般传代比例为1:4～1:6，视细胞密度而定。如分化细胞多，应先取出分化细胞，再进行传代。
（2）monESCs冻存
①冻存细胞时，最好提前2 h更换新鲜培养液。
②准备冻存液C并放到冰上预冷。
③按monESCs传代的方法，用Ⅳ型胶原酶消化、离心收集细胞团块悬液。
④吸弃上清，加入合适体积的冻存液C，细胞的浓度最好能在2×106～5×106 cells/mL，轻轻地吹打细胞，之后分装到冻存管，一般来说每个冻存管内的细胞可以复苏到6孔培养板的一个孔中。
⑤用程序冻存盒或分步法冻存细胞，记录细胞名称、冻存时间、冻存代次、复苏剂量、冻存者姓名等信息。
！注意：-80℃冻存不要超过3日，3日内需转入液氮中长期保存。
（3）monESCs复苏
①复苏前一天首先准备好MEF饲养层细胞，饲养层细胞要求密度为1.2×104～1.5×104 cells/cm2，切忌密度过高。
② 37℃水浴锅中预热monESCs培养液。
③从液氮中取出细胞，放到37℃水浴中迅速融化，可以用镊子夹住来回搅动至融化。
④把冻存的细胞悬液约0.5 mL转移至15 mL离心管中，之后逐滴加入预热过的monESCs培养液约4.5 mL(冻存细胞体积∶复苏时培养液体积=1∶9)，室温1000 r/min离心3 min。
⑤用monESCs培养液重悬细胞后接种到事先准备好的饲养层细胞上。
⑥每日更换新鲜monESCs培养液。
！注意：monESCs在冻存后存活率较低，仅有20%～30%，可能的原因是monESCs培养的技术体系不如小鼠和hESCs培养的技术体系成熟。monESCs复苏后前几日克隆可能观察不明显，如培养至7日以上仍未见克隆形成可放弃此次复苏，如发现克隆形成，一般需培养至10～14日进行传代。