未知物鉴定：1ppm不够，谱图准确度帮大忙

——访MassWorks软件发明人思路生科公司总裁王永东博士

　  【导语】美国分析化学（Anal. Chem.）期刊封面，在9月号刚发表了题为“The Concept of Spectral Accuracy for Mass Spectrometry"的文章，这本有着分析化学风向标美誉的期刊，第一次在学术上公开表示了对“质谱谱图准确度”的认可。最近，我们有幸通过越洋电话，采访到此概念的发明人王永东博士和他的同事顾鸣博士，他们将为我们展开介绍谱图准确度给每位质谱工作者带来的好处……

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　　什么是“质谱谱图准确度”？

　　首先，顾鸣博士为我们介绍了什么是“质谱谱图准确度”（Spectral Accuracy for Mass Spectrometry）。

　　我们所讨论的质谱谱图就像紫外/可见光和傅里叶红外光谱一样是连续曲线，它的纵轴是信号强度，横轴是质荷比。但质谱与其它分析技术相比的不同之处是质谱的理论图谱可以非常准确地计算出来。所以我们可以很有效地比较理论谱图与试验谱图。简而言之，谱图准确度的定义是试验谱图与理论谱图相比之下的差距。 比如说，试验测量的谱图与理论谱图（在去掉关系试验谱图强度的常数后）一模一样，这个实际测量的质谱谱图准确度就是100%。

　　在此之前，很多质谱工作者都了解“质量准确度”（Mass Accuracy），目前TOF、Orbitrap、FT MS等仪器都在强化人们的“质量准确度”意识，比较公认的说法是：当质量测定得足够准时，可以直接获得化合物的化学式，或者把候选物质的数目尽量减少，帮助人们快速对化合物进行定性。

　　当笔者问道“谱图准确度”和“质量准确度”的区别时，顾博士用一个比喻形象作答：“质量准确度是一维单点的测量；而谱图准确度是二维多点的测量。打个比方说，质量准确度是看见了树木没看见森林。”

　　说到这里，顾博士举了一个例子。应用CHONF五种元素在质量准确度1 ppm的条件下搜索一个测出质荷比等于823.4130的未知物，会得到共计58个不同的分子式（事先我们知道其分子式是C₄₃H₅₉N₄O₁₂）。仅仅根据质量准确度来鉴定这个未知物几近大海捞针、是完全不可能的。但有了谱图准确度的帮助，未知化合物谱图可以与58个在1 ppm质量准确度范围内分子式的谱图进行一一比较，正确的未知物分子式（C₄₃H₅₉N₄O₁₂）获得高达99%谱图准确度名列第一，所以可以轻而易举地被确定。恰恰相反的是，如根据质量准确度来鉴定， 正确的分子式仅排列第五；而排列第一到第四的分子式都是错误的。比如其中C₃₅H₅₁N₁₂O₂F₈的质量准确度高达0.02 ppm，排在仅凭质量准确度搜索的第一位，却因谱图准确度只有95%而排在依据谱图准确度搜索结果的第13位。此例充分说明，没有谱图准确度，仅依赖质量准确度去鉴定未知化合物不仅难度大、而且会导致错误的结果，因为它“只看见了单点质量准确度这一棵树”，而“没有看到谱图的整片森林”。

谱图准确度和质量准确度的区别：
图中红色是按照谱图准确度搜索谱图匹配最好的、正确的分子式结果；
而蓝色是错误的分子式，即使它的质量准确度非常高，但谱图准确度却不高

　　 “质谱谱图准确度”为什么很重要？

　　王永东博士任总裁的思路生科（Cerno Bioscience）公司研发的MassWorks软件中，集中应用了谱图准确度的ZL技术。对于记者提出的“谱图准确度为什么很重要？”的问题，王博士谈到了下列几点：

　　（1）由于质谱谱图上所有的点 都用于谱图准确度的计算，所以它是更为完善和全面的指标。

　　（2）谱图准确度不仅有很大的学术价值，而且有重要的实用价值。

　　（3）应用谱图准确度可以解决许多先前难以想象的问题。

　　（4）谱图准确度既适合低分辨又适合高分辨质谱仪。所有质谱厂家仪器都可以应用谱图准确度来帮助确定未知物的分子式。

　　总结来说，MassWorks软件可用于任何质谱的定性工作，特别适用于未知物的定性，而不论质谱图库中是否包含这个未知物。如果有质谱图库，这套软件可用作图库查找时完全独立的验证；如果没有质谱图库可查，则非用这套软件不可，不然在低分辨的质谱仪上没法定分子式，在高分辨的有精确质量的仪器上常会定错分子式而全然不知。

　　王博士还特别谈到：由于《分析化学》上的这篇专门介绍谱图准确度的文章发表，标志着学术界对谱图准确度概念的正式接受；过往的学术争论也因此结束。这对于希望以谱图准确度发表文章的用户来说，是个很好的消息。

　　“质谱谱图准确度”的用途和好处

　　谈到质谱谱图准确度的应用，王永东博士更是如数家珍地举了若干个代表性的应用：

　　（1）用低分辨四极杆质谱确定未知化合物元素组成：

　　用质谱确定分子式由来已久都是由傅里叶变换（FT MS）和时间飞行（TOF）这些高分辨仪器垄断；但这样的仪器购买维持的费用很高，操作也不简单。用低分辨四极杆质谱确定未知化合物元素组成曾经被认为是不可思议的；有了谱图准确度后，这样的分析正如一位用户所说的便成了“举手之劳。”

　　（2）复杂质谱的分析：

　　无论是高分辨或低分辨质谱，不同离子的质谱峰会相互重叠。利用谱图准确度可以将这样重叠的质谱峰以数学的方法分开。这对石油化工中碳氢化合物或生化领域复杂质谱的分析具有十分重要的意义。

　　值得一提的是，对质谱图相互重叠的离子，MassWorks已提供可在定性时同时进行定量的功能。

　　（3）质谱仪问题的诊断：

　　谱图准确度完整地描述了质谱曲线上所有点的测量准确性，因此，如果质谱仪出了问题，谱图准确度可提供仪器诊断信息，帮助用户有所警觉。比如，检测器也许有线性范围的问题，或者质谱图上有干扰峰的出现。对于质谱仪的研发人员来说，谱图准确度还会给仪器工程师准确的反馈，从而设计和制造出具有最好质量准确度和谱图准确度的下一代仪器。

　　具体到谱图准确度为中国用户提供的好处，王博士还特别强调了几点内容：

　　中国有很多现有或即将购买四极杆质谱（如四极杆气质联用仪、串联四极杆气质联用仪、四极杆液质联用仪、串联四极杆液质联用仪）的用户。在这种仪器上应用谱图准确度来确定分子式是经济实惠切实可行的途径。因为它投入少，维护容易，对操作人员要求不高。

　　MassWorks是个极其环保的绿色产品；对于很多需要更多了解质谱原理的科技人员来说，MassWorks还是质谱教学/教育的好工具。

　　中国在食品安全、环境安全、生物医药研发外包（CRO）、中药/天然产物鉴定等方面有全球特色的应用，这些应用都涉及未知物的鉴定，因此MassWorks软件是不可或缺的有力工具，不论是对低分辨还是高分辨质谱用户。

　　“我们在向世界各地推广的过程中发现，工业愈发达的地方，对分析的要求愈高愈仔细，用户对MassWorks的认可愈高。举例来说，我们在海外有不少酒业方面的用户；中国是个很大的酒业生产和消费国，MassWorks软件对这些酒业用户将会提供强有力的帮助，帮助它们更好地鉴别和区分各种层次、各种级别的产品。”

　　王博士还特别指出，MassWorks产品兼容于全球所有的各大质谱厂商，而且操作简便、容易：“它是一套专门用来后处理质谱数据的定分子式的软件，不需要控制质谱仪；由在分析界极富经验的软件开发人员设计制作，所以对分析人员来说，它的应用和操作非常简单。”

　　刚才王博士曾提到“MassWorks软件是不可或缺的有力工具，不论是对低分辨还是高分辨质谱用户。”记者忍不住问道：“目前，全球和中国的很多客户都在购买TOF类、Orbitrap类的高分辨率质谱，TOF、Orbitrap上能用这套软件么？用了会有什么好处？”

　　王博士回答道：“我们现在有许多TOF 和Orbitrap 用户，他们的确需要谱图准确度来帮助他们进一步减少鉴定未知物时的假阳性。 比如说， 用这些仪器得到了 5ppm 质量准确度， 但检索分子式时往往还有一大堆（比如十个到几十个），没有谱图准确度的帮忙是无法准确地鉴定未知物的。另外，我们在软件的推广中遇到很多因为一味依靠高分辨仪器上的质量精确度而将分子式定错的例子（包括好些个FTMS的用户）。这种错误通常会给研究或企业的产品带来不可估量的损失。这些错误中的绝大部分都可通过MassWorks的谱图准确度来消除。”

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　　“质谱谱图准确度”是如何诞生的？

　　接受访谈的王永东博士和顾鸣博士，都是早期留美的华裔人士，他们是思路生科公司(Cerno Bioscience)公司的创始人。关于他们为什么要发明“谱图准确度”，首先要了解一下他们两位的“出身”和Cerno Bioscience公司的辉煌经历。

2006年Pittcon获奖后的照片，图中左二是顾鸣博士，右二是王永东博士

2006年Pittcon会议，MassWorks获奖的奖牌

　　王永东：获华盛顿州立大学化学系分析化学专业博士。专攻化学计量学在分析化学中特别是光谱中的应用。毕业后就业于PerkinElmer公司从事仪器开发和应用的研究，后升任科学技术部主任并获取哥伦比亚大学商学院企管硕士。

　　顾鸣：获华盛顿州立大学化学系分析化学专业博士。专攻质谱仪器的设计和应用。毕业后在该校分子生物系从事三年蛋白组学的博士后研究。之后就业于恵氏和施贵宝制药公司开发应用于药物代谢以及大分子药物的质谱分析方法。

　　两人于2003年在美国康州创建了思路生科公司(Cerno Bioscience)公司，王、顾两人分别任总裁和技术总监。思路生科公司拥有12个全球范围内的质谱ZL和独具一格的质谱数据处理软件MassWorks。MassWorks自2006年投放市场，即荣获当年匹兹堡最富有创新产品的铜质奖章，备受所有质谱厂家和质谱工作者的广泛关注。该产品不仅在质谱技术上获得标志性突破；而且能直接给质谱终端用户带来前所未有的功能。 MassWorks自发明以来，行销全球各地（包括中国）众多的行业，已成为质谱工作者鉴定未知化合物必不可少的工具。

　　关于为什么要研发MassWorks软件和谱图准确度，王博士表达了科学工作者对于技术创新的酷爱之情：与其说是以营利为宗旨，不如说是填补了一项质谱技术的空白，并将它开发成具有实用价值的产品。这起码有三个方面可以说明。

　　第一、在质谱行业长期以来一味追求高质量准确度，从而忽视了同位素分布这一非常重要的信息。通过这个产品我们引进了谱图精确度的概念。事实上数不胜数的例子， 会使更多的质谱科技人员认识到谱图准确度的重要意义。

　　第二、谱图准确度是用连续质谱图（Profile）来计算的。与以往用棒棒图（Centroid）来比较同位素分布， 其效果会有天壤之别。

　　第三、理论上计算的质谱图是离散性的，而质谱仪上观察到的是连续曲线，其间有荷质比的位移（质量误差），更重要的是带有质谱仪特征的峰型函数。将理论质谱图与实验质谱进行精确的比较是我们发明这套技术的直接推动力。

　　“我们在软件的推广中遇到很多因为一味依靠质量精确度而将分子式定错的例子。这种错误通常会给研究或企业的产品带来不可估量的损失。这些错误中的绝大部分都可通过MassWorks的谱图准确度来消除。这让我们感到很高兴、很有成就感！”

　　在产品的全球推广中，ZL是非常重要的。据顾鸣博士介绍，MassWorks软件是具有12个世界范围ZL保护的独特产品。“我们至今还没有发现有同类产品能够与我们竞争，这是因为我们有独一无二的质谱标定技术。简单来说，通常的质谱只做质荷比的标定，而我们的标定既校正质荷比、又校正质谱的峰型。这也是我们能应用最简单的四极杆来做未知化合物分子式确定的关键所在。由于我们的技术受到世界各国的ZL保护，为我们的产品确立了一个独一无二的位置，也使得产品可以获得全球范围的广泛应用，获得全球各行业用户的广泛反馈。值得一提的是，我们的第一个ZL最近已获中国ZL局的批准。”

　　“质谱谱图准确度”和MassWorks业已取得的成绩

　　据了解，MassWorks软件已行销西欧、北欧、北美、亚洲的众多国家。全球几乎所有大型制药公司都是MassWorks的用户。其他的客户分布于石油化工、香精香料、环境保护、安全检测，药品检验，食品安全行业等等不胜枚举。

　　“我们帮助客户解决的最常见问题是——未知化合物分子式确定。 我们正与许多大公司协商互利的合作关系；特别是，我们与安捷伦共同开发MassWorks在其气质联用方面的应用已有相当长的一段时间。”顾鸣博士说。

　　MassWorks软件自推出以来，获得了无数客户的好评。

　　TOF用户评价：“祝贺你们， sCLIPS再一次给我留下深深的印象。 两次的盲样测试，你们鉴定的分子式的第一选择都是正确的结果。此外，我发现对高分辨质谱数据，你们竟然不需要利用标准化合物进行标定，仅仅利用同位素的信号就可以做分子式的鉴定。 这简直是太神奇了。” ——这是西瓦克教授在两次盲样测试（Leco LC-TOF）得到正确结果后的感受。

　　四极杆GCMS用户评价：“自从2007年夏季我就测试和使用MassWorks这个软件。我的主要目的是应用这个软件鉴定分子式的性能去进一步核实气质未知化合物NIST谱库检索的结果。尤其是当检索结果显示多种化合物具有相似匹配值时，MassWorks会提供另一个独立的分子式帮助确定未知化合物。相对来说，这个软件简单易用。在我所测试的各种类型多于二百的化合物中，大部分由MassWorks分析结果都将正确的分子式排在第一位。”——美国一州政府环保实验室用户

　　三重四极杆液质联用用户评价：“使用MassWorks非常简单，一学就会。我仅仅花了几分钟的时间就得到了第一次振奋人心的结果。我们在使用了十年有余的三重四极杆上，通常可以达到10 ppm 或者更好的质量准确度。这个软件已成为我们鉴定合成化合物的重要组成部分。”

　　更多评价，请见MassWorks专题 http://www.antpedia.com/special/massworks.html

　　对于四极杆、飞行时间（TOF）、Orbitrap等质谱，MassWorks和其谱图准确度已经证明了其强大威力，但对于离子阱质谱是不是有可能用MassWorks呢？针对记者的疑问，王博士回答说：“离子阱类仪器有空间电荷效应， 通常得不到四极杆仪器所得到的效果。但其中，线性离子阱的空间电荷效应似乎并不太严重。我们有不少在线性离子阱鉴定分子式方面的成功例子。最近我们发现，有某大质谱仪厂家希望利用MassWorks中的谱图准确度，来帮助他们测定离子阱类仪器空间电荷效应的大小，以进一步改善离子阱的功能。我们相信在不远的将来，由于谱图准确度所带来的反馈信息，离子阱在谱图匹配、定量、动态范围等方面的功能将会愈来愈接近四极杆仪器。”

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