湖南农业大学最新文章比对两种基因组编辑技术

　　TALEN(Transcription activator-like effector nucleases)系统和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系统是当前广泛应用的两大基因组编辑技术。

　　来自湖南农业大学生物科学技术学院等处的研究人员比较分析了水稻(Oryza sativa L.)中这两大系统诱导突变的突变率、突变类型、突变位置、突变时间和遗传模式,解析了双靶点 CRISPR/Cas9 系统的突变特征，以期为这两种技术更好的应用于水稻功能基因组研究和分子植物育种提供理论参考。

　　近年兴起的基因组编辑技术以其能精确修饰DNA 的特性，成为当前最受瞩目、最有影响力的生物技术之一，在基因组功能研究、作物遗传改良、基因治疗等方面得到广泛应用。基因组编辑技术以锌指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)、 成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9, CRISPR/Cas9)为代表， 已在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)等多种高等植物中成功实现了基因的定点敲除、敲入、替换等修饰。其中， TALEN、CRISPR/Cas9 分别被 Science 杂志评为 2012 年度、2013 年度十大科技进展之一。在作物性状改良方面，二者均展现出很好的应用前景。

　　水稻是重要的单子叶模式植物，也是主要的禾本科粮食作物。研究 TALEN、 CRISPR/Cas9 在水稻中诱发的突变特征及遗传稳定性，对这两种技术应用于水稻基础研究和育种实践具有重要意义。目前，已报道的研究多聚焦于靶标性状的获得和靶向突变的效率分析，仅少数报道统计了这两种系统在水稻单个靶位点引入的突变基因型、并分析了遗传模式及脱靶效应。

　　这项研究比较分析了 TALEN 和CRISPR/Cas9 两大系统靶向诱变水稻的突变率、突变类型、突变位置、突变时间和遗传规律，解析了

　　双靶点 CRISPR/Cas9 系统的突变特征。

　　这两大系统都以诱发10 bp以内的InDel突变为主,TALEN系统易诱导10 bp以内的缺失突变,而CRISPR/Cas9系统易诱导1 bp的插入突变,且CRISPR/Cas9系统诱发的DNA双链断裂(Double-strand breaks,DSBs)位置更加精确。此外,DSBs在修复过程中能以低频同源重组(Homologous recombination,HR)途径修复,产生DNA片段重复突变。

　　对于相邻双靶点CRISPR/Cas9系统而言,双靶点间的DNA片段可发生缺失或倒位,这种双靶点间DNA片段突变的发生频率与双靶点各自的突变率无正 相关性。两大系统诱导的突变最早发生在已转化的愈伤组织中,少量发生在水稻的体细胞中,导致了纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变4种遗传模式,其 中双等位突变比例最高,嵌合突变比例最低。除嵌合突变外,纯合突变、杂合突变、双等位突变的突变序列均可稳定遗传给下一代。

　　作者指出，一个理想的基因组编辑技术应具有以下特点：

　　(1)靶向突变活性高，转基因低世代有较高的突变率；

　　(2)突变位点特异，脱靶率低；

　　(3)突变类型多样，易

　　于找到符合要求的突变体；

　　(4)有一定比例能稳定遗

　　传的突变体；

　　(5)对于应用研究而言，在转基因低世

　　代(如 T1 代)易彻底分离所有的转基因成分。

　　这项研究发现，用农杆菌介导 TALEN 系统和 CRISPR/Cas9系统转化水稻最早可在愈伤组织发生突变，在 T0 代能有效或高效地获得可稳定遗传的各种突变体，通过选择特异性高的 CRISPR/Cas9 靶序列，可以有效控制脱靶效应。此外，研究(未发表数据)表明，在 T1代转基因分离群体中可以筛选到不含转基因成分的纯合突变体和双等位突变体。

　　相比 TALEN 系统而言， CRISPR/Cas9 具有不少优势：靶序列更广泛、载体构建更简单、突变更高效，不受 DNA 甲基化影响，可同时敲除多达 8~10 个靶位点，易形成靶点间 DNA 片段缺失等突变。因此，总体而言CRISPR/Cas9 是更为理想的基因组编辑工具，但对于玉米等只有一小部分基因组转录本能找到 CRISPR/Cas9 特异靶位点[29]的物种而言， TALEN 系统则提供了一个相对特异的基因组编辑方式。