INCSeq：提高纳米孔测序准确性的新方法

　　新加坡基因组研究院（GIS）的研究人员开发了一种方法，称为INC-Seq，能够提高牛津纳米孔技术公司掌上测序仪MinIon的测序准确性。目前他们正努力改进该方法，将它应用到复杂样本的16S测序、RNA测序以及基因组复杂区域测序等中。

　　研究人员在近日发表于《Giga Science》的文章中描述了该方法。GIS计算与系统生物学副主任NiranjanNagarajan说，纳米孔测序是一项令人兴奋的技术。但是这种技术的致命弱点在于测序原始数据的准确性以及系统误差。他的团队希望找到一种方法来提升MinIon的准确性。

　　INC-Seq的原理

　　他们开发的方法借鉴了PacBio公司的环形一致性测序模式（circular consensus sequencing，CCS）的概念：通过对同一个分子反复测序，可以计算出一致性序列，进而提高准确性。

　　虽然纳米孔测序时DNA模板必须是线性的，但GIS研究小组的方法是使用滚环扩增，来产生一个环状的DNA分子，它由一个DNA扩增子的串联重复组成。

　　这种方法被称为分子内连接的纳米孔一致性测序（intramolecular-ligated nanopore consensus sequencing，INC-Seq）。该方法首先需要环化模板DNA分子，然后研究人员利用滚环扩增来扩增分子，生成由多个重复单元组成的环状分子，这些环状分子随后在测序前被打断成线性DNA链。

　　Nagarajan说，“对来自同一原始序列的DNA reads进行多次测序，使我们可以通过计算合并这些信息，得到原始DNA序列的准确read。”

　　INC-Seq的验证

　　为了进行概念验证，研究人员首先将这种方法应用到16S RNA测序中，16S RNA测序是一种鉴定混合样品中细菌的方法。16S序列可能是相似的，因此长读长和准确读取非常重要。

　　研究小组首先利用合成序列来验证该方法，将INC-Seq方法和标准的MinIon测序方法产生的2D reads进行比较。结果表明，只有72%的2D reads可以比对到正确的参考序列上，88%可比对到相同物种的参考序列上。而INC-Seq产生的reads中有92%可以比对到正确的参考序列上，99%能比对到相同物种的参考序列上。

　　研究人员接下来在菌群中测试了该方法，该菌群包含了S. cristatus、S. oralis和P.micra。他们发现，利用INC-Seq进行16S RNA测序将reads的准确率提升至97%，而标准2D reads的准确率仅84%。错配率由7.5%降低了十倍至0.7%。此外，该方法还能计算出每个物种的正确丰度。

　　研究小组接着又对一个更加复杂的菌群进行了测试，该菌群包含了10种不同丰度的微生物。利用INC-Seq技术进行16S测序能够检测出每个物种的相对丰度，但是对于最丰富的物种会出现一些问题，这表明该技术可能受到了扩增偏差的影响。

　　INC-Seq的改进

　　Nagarajan说，他的团队正在改进该方法。他们正在研究使用哑铃状接头，替代滚环扩增，来使相同的DNA分子进行多次测序。每个DNA分子的两端都连接上一个发夹环，确保该分子能够被重复读取。

　　Nagarajan表示，这种方法比滚环扩增更好，后者容易导致偏差。例如，在滚环扩增中，有时DNA会粘在一起，有时聚合酶会从一个模板跳到另一个，这会导致来自两个不同模板序列的混合read产生。哑铃状接头方法同时还能减少运行周期，把时间从一天减少到几个小时。

　　Nagarajan还在测试该方法的其他应用，例如RNA测序和组装分析。他最感兴趣的是将该方法应用到RNA测序中，研究复杂基因、同源异构体和大型基因家族。此外他还希望利用该技术澄清人类基因组中的一些复杂区域。

　　Nagarajan表示，如果他们能够成功开发出哑铃状接头方法，它将成为对复杂样本进行快速16S测序的好方法，可以准确鉴定物种，甚至是株系，例如，在农田里鉴定特定的作物病原菌。

　　任何人都可以免费使用该方法。Nagarajan说，他和牛津纳米孔公司在讨论开发一个改进版本提供给用户。该实验方法非常简单，目前已经有很多实验室在使用它了。