2016年诺贝尔生理学或医学奖揭晓,来自东京工业大学的大隅良典Yoshinori Ohsumi因发现自体吞噬的机制而获得此奖,他的代表论文包括:
Autophagy in yeast demonstrated with proteinase-deficient mutants and conditions for its induction
这篇论文是Ohsumi获得诺贝尔生理或医学奖的关键成果,即证实了酵母的自噬过程。
液泡是一个细胞器,相当于人体中的溶酶体。酵母细胞比较容易研究,因此它们经常被用来作为人类细胞的模型。尤其是用来鉴别对复杂细胞途径非常重要的基因方面特别有用。酵母细胞非常小,内部结构在分辨显微镜下也不容易看到,因此Yoshinori Ohsumi 也不确定酵母体内是否存在自噬。自噬过程是活跃的,如果他能扰乱液泡中的降解过程,那么自噬体会在液泡中积累,从而在显微镜下可见。
因此Ohsumi培养了液泡降解酶缺乏的突变酵母,同时慢慢地刺激发生自噬,结果是惊人的。不到一个小时,液泡中充满了未退化的小囊泡,就是自噬体。他的实验证明了酵母中存在自噬。更重要的是,他有一个方法来验证和表征这个过程中的关键基因。
Isolation and characterization of autophagy-defective mutants of Saccharomyces cervisiae
随后,Ohsumi 开始利用他构建好的酵母基因工程菌开展进一步研究。如果对自噬有影响的基因失活,那么这个自噬体积累过程不会发生。他将酵母细胞暴露中化学物质中来实现对一些基因的随机突变,然后他诱导了自噬,结果奏效了。
这篇论文就是hsumi发现酵母中存在自噬的一年后,发现了和自噬有关的第一个基因,在他随后的研究中,由这些基因编码的蛋白被表征,其研究组通过筛选上千个酵母的突变株,鉴定了15个和自噬有关的关键基因。
Analyses of APG13 gene involved in autophagy in yeast, Saccharomyces cerevisiae
a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae
这两篇1997年的文章在酿酒酵母中克隆出了两个自噬调控基因,开启了自噬的分子研究时代。
A protein conjugation system essential for autophagy
这篇论文对于Ohsumi获奖也至关重要——他发现了ATG12-ATG5 自噬通路。
许多蛋白质协同作用形成自噬体是自噬过程的一部分,ATG12和ATG5这两种蛋白正确连接可形成一种称作自噬小体(autophagosome)的细胞器。自噬体可像垃圾袋一样移除有毒物质,通过再循环向细胞提供营养物质。
LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing
同时Ohsumi等人还发现了自噬小体(autophagosome)的标志性蛋白 LC3-II。LC3是自噬系统的一个关键蛋白,来吞噬桩蛋白,并将其运输到溶酶体,在那里它被降解。
LC3 蛋白有两个形式,正常状态下以 LC3-I 的形式存在,自噬发生的时候,LC3-I 发生脂化和剪切形成 LC3-II。 LC3-II 移位到自噬小体上,成为目前自噬细胞研究的标志性检测蛋白。
附:如何检测原代细胞中的自噬
自噬是个复杂的过程。在哺乳动物中,Atg8家族的8个成员被鉴定出。最为人熟知的是LC3,这是大多数经典的自噬检测分析中的关键分子。LC3的脂化导致LC3(LC3-II)在western blot中比非脂化形式(LC3-I)跑得慢,因此可以检测。当自噬水平低时,LC3-I均匀分布在细胞中,而一旦自噬发生,LC3的脂化导致其重新定位到自噬体上,这可以通过免疫荧光显微镜来观察。第三种经典方法就是利用电镜来观察双膜的囊泡。
还有一些注意事项。比如,在检测原代细胞混合物中一种细胞的自噬时,需要进行细胞分选。然而,磁珠或流式细胞仪的分选会诱导自噬的形成,导致难以分辨。这时可利用ImageStream成像流式细胞仪来鉴定细胞类型,并同时测定自噬,从而避免分选。
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