【干货】细胞冻存与复苏

　　很多时候，我们需要把细胞冷冻起来，以便于长期保存，以备不时之需。而复苏，就是使冷冻的细胞苏醒过来，恢复活力。

　　其实，细胞冻存和复苏的protocol教科书和实验手册上面都有，毛博我不想再重复了。这里，毛博根据自己做细胞培养近10年的经验和体会，谈谈应该注意的一些事项和技巧。大部分都是血泪教训和经验总结，都是干货哟。

　　一、冷冻越慢越好，复苏越快越好

　　高大上的实验室可以使用程序冷冻仪，一切由机器代劳，屌丝实验室就只好用人肉程序冷冻仪。具体的protocol，到处都有。毛博想提醒大家的是，细胞冷冻越慢越好，宁慢勿快。做细胞冷冻前，事先留出充足的时间。

　　而复苏速度越快越好：从液氮罐里取出来之后，迅速放在37°C水浴中，然后使劲摇呀摇，令其尽快融化。

　　二、高高兴兴上班，平平安安回家

　　细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面最容易出事的部分，凡是和液氮接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。最需要小心的是：复苏的时候，在水浴中摇呀摇的时候，有时候小瓶会爆炸的。所以，一定要戴保护眼镜和手套。

　　不多说了，说多了满眼都是泪。还有，冻存液中的DMSO是有毒致癌的，接触的时候一定一定要带好手套。

　　三、冻存细胞数量要足够

　　无论再怎么小心，细胞在冷冻和复苏过程中总会死掉一批的。所以，一开始冻存细胞的数量要足够。一般最低要达到5×106／毫升，一瓶不够两瓶凑。但是，这个不能一概而论。有些细胞，比如：杂交瘤细胞，只需要1－3x106／毫升。

　　四、做好标记

　　把培养瓶放入提手，末端应该扎有小牌，注明主人的名字，细胞名称和冻存日期。还要在每个冻存管上写上细胞名称，代数和冻存日期。

　　实验室的液氮罐都是公用的，每个人应该有属于自己的提手。毛博当年就发生过为了找自己的细胞，被迫把整个液氮罐翻了个底朝天的惨剧。

　　五、细心呵护

　　刚刚复苏的细胞就象刚刚出生的baby，非常脆弱，需要我们的细心呵护。培养液要事先在培养箱或者水浴中复温，一切的和细胞接触的动作都要轻柔。

　　把细胞从冻存管里吸出来，注入离心管，要轻轻地吸取和滴加。包括给离心管补加培养液的时候，都要轻轻地滴加。离心要用低速离心（500－1000转／分钟），吹打要用专用的吹打管，而不要图方便用移液枪，吹打也要轻轻的。

　　六、DMSO的问题

　　上面提到了DMSO是一种有毒致癌物质。那么，解冻之后，应不应该去除冻存液中的DMSO呢？答案是no。除了极少数特别注明的对DMSO敏感的细胞外，99％的细胞都不需要去除DMSO，解冻后的频繁换液会慢慢去除掉DMSO的。

　　七、物离乡贵，人离乡贱

　　解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清。因为每一种细胞都有自己特定的，并且已经熟悉了的生长环境。突然使用不一样的培养液和血清，会造成细胞生长不良，甚至死亡。这和一个人突然离家千里，会水土不服是一样的道理。

　　细胞培养是个苦活，根本离不开人。毛博还记得当年当实验狗的时候，放个长假都要惦记着培养箱里面的细胞是不是该换液了。而掌握了有效的冻存和复苏的技术，就可以解决这个问题。春节回家前把细胞都冻上，过了年回来再开干。