赛默飞世尔科技：为蛋白质组学提供深层次解决方案

　　【导语】 毫不夸张地说，蛋白质组学的兴起推动了整个质谱的研发和应用，使质谱产品层出不穷，并应用于更多的组学、更多的复杂体系研究中。蛋白质组学面临的挑战也促使质谱的研发者们不断推出创新的技术，比如第6种质量分析器Orbitrap的出现，以及随之出现的一系列新的研究流程和方法。在第六届AOHUPO会议期间，本网记者有幸采访到赛默飞世尔科技蛋白质组学市场总监 Andreas FR Huhmer博士，赛默飞世尔科技蛋白质组学软件战略营销经理 David Horn博士和赛默飞世尔科技色谱质谱中国区市场经理王勇为先生，他们将为我们详细介绍在蛋白质组学研究领域，Thermo Fisher Scientific从生物样品前处理产品、到色谱产品质谱产品、以及蛋白质组学数据处理软件产品等整个分析流程中拥有的创新产品技术及其应用，希望对您正在进行的方向有帮助……

赛默飞世尔科技蛋白质组学软件战略营销经理 David Horn博士（左），赛默飞世尔科技蛋白质组学市场总监 Andreas FR Huhmer博士（右）

蛋白质组学领域面临的挑战

　　2001年国际人类蛋白质组组织的成立，极大地推动了蛋白质组研究的发展。10年来，国际蛋白质组学无论从技术方法和研究策略，还是研究资源和研究领域等都有了质的飞跃。国际上主要发达国家和地区纷纷加大对蛋白质组学的支持力度，这一研究领域也由此成为各强国科技角力的新战场。本次AOHUPO大会上，秦钧教授介绍了2010年开始立项的中国“凤凰工程”计划，将使中国站在蛋白质组学研究新的国际制高点上。连Huhmer博士也不禁赞叹：中国对于蛋白质组学的投资和决心是世界上非常突出的。

　　近年来在蛋白质组定量分析，翻译后修饰研究、规模化相互作用及功能研究、 生物标志物的筛选验证、抗体制备、数据标准和数据挖掘等方向，科学家们取得了一系列突破性进展。蛋白质组学技术已成为几乎所有国际著名医学研究机构的重要支撑平台，在疾病研究中的应用更加广泛。国际上也先后启动了多种疾病的蛋白质组研究计划，目标是直接寻找疾病相关特异蛋白质或对疾病相关已知蛋白质进行深入机制分析。

　　当谈及蛋白质组学目前面临的主要技术挑战时，Andreas FR Huhmer博士告诉我们，当前蛋白质组学领域最大的讨论热点还是蛋白质组样品的复杂性，如何使方法具有足够的灵敏度、检测到所有蛋白的信息，找出有意义的生物标志物，定性、定量并解释它们，是当今面临的最大挑战。例如各种癌症的蛋白质组是非常复杂的，生物学家们还没有办法搞清楚里面有多少相关的组分，也不能给予充分的生物学解释，因此，目前还不能攻克。

创新技术及完整操作流程解决方案

　　在蛋白质组学如此复杂的研究中，当谈及赛默飞世尔科技如何能够保持其竞争优势时，Huhmer博士言简意赅地回答到：“创新（Innovation）！”

　　接下来他谈到，质谱技术由于具有极高的灵敏度、对于复杂物质体系强大的解析能力，成为蛋白质组研究的核心工具，也是目前蛋白质组研究技术中最具活力和潜力的技术。赛默飞最大的竞争优势正是在于质谱技术的不断创新，比如推出世界上独一无二的Orbitrap质谱。同时不仅限于质谱，赛默飞还提供非常创新的化学试剂（如TMT、SILAC）、高效的分离产品、以及数据处理软件产品等。拥有了这些独立的创新产品后，赛默飞提供了从前端处理、分离，到仪器、到软件的完整工作流程解决方案，这是其它的竞争者所无法做到的。通过这些创新产品和完整的工作流程，赛默飞能帮助科学家们大幅提高研究工作的效率，更有信心地面对蛋白质组学的挑战。

蛋白分析整体操作流程解决方案

　　采访中，Andreas FR Huhmer博士与David Horn博士为我们详细介绍了整个操作流程中的相关创新技术及其应用。

　　Orbitrap技术，使赛默飞再次成为质谱全球领导者

　　数十年来，质谱界的质量分析器只有5种：四极杆、离子阱、飞行时间、磁质谱、FT ICR，而Orbitrap的出现，给了全球一个惊喜——这是第6种质量分析器。在AOHUPO会议期间的workshop中，Huhmer博士向大家回顾了Thermo Scientific Orbitrap质谱技术的发展历程。1999年提出了Orbitrap质量分析器的概念；2000年实现了Orbitrap质谱分辨率>100,000；2005年推出了首台商品化的LTQ Orbitrap质谱；2008年推出建立在Orbitrap技术基础上的Exactive台式LC-MS系统；2009年推出了LTQ Orbitrap Velos轨道阱质谱仪；2011年ASMS上，推出了分辨率达14万的新型Q Exactive复合式高性能台式四极杆-轨道阱质谱仪，和分辨率高达24万的Orbitrap Elite高场轨道阱组合质谱仪。

　　在整个蛋白质组学研究过程中，赛默飞在各个阶段都提供了质谱解决方案，并进一步使其成为更容易获得和操控的台式仪器。在发现（Discovery）阶段，可使用Orbitrap进行蛋白质鉴定和相对定量；在目标物验证（Target Verification）阶段，可使用Q Exactive进行绝对或相对的定量；在目标物定量（Target Quantitation）阶段，可使用TSQ Vantage三重四极杆质谱进行绝对的定量。

　　谈到Orbitrap质谱的创新，Huhmer博士深情地表达：“People love Orbitrap”（人们热爱Orbitrap）。Orbitrap技术之所以如此流行，原因就是，这是一种超高分辨、超高性能的仪器，以前操控这种技术需要质谱的专家，令有很多天才想法的生物科学家们望而却步。而Orbitrap使分析人员非常容易上手和操控，并获得极其“漂亮”的结果。以前，只有质谱领域的专家才能够做几十万分辨率的试验，Orbitrap技术出现后，现在任何水平的分析人员都可以去做几十万分辨率的质谱分析，这是个很大的改变。

　　Huhmer博士还分享了一个实例：“哈佛大学生物系的研究者们有很多创新的想法，但要获得好的数据，以前都要将样品送到外面去检测。现在他们自己买了Orbitrap仪器，自己可以开始分析这些样品，并获得同样甚至更好的结果。其中很重要的一个原因就是，Orbitrap能够被很多人掌握、使用。这些专门搞生物学研究的应用科学家们，也可以直接操作质谱，获得完美结果。”

　　 笔者追问：“那对于能够使用FTICR-MS的专家们，Orbitrap是不是就没有竞争力了呢？”严谨的Huhmer博士回答道：“FTICR-MS确实能够做一些特别的事情，最主要还是依靠它更高的分辨率。但FT-MS对于纯品或不太复杂的样品也许更有用；对于LC-MS，却由于采集速度等问题无法很好实现联用，即针对如蛋白质组学这样复杂的样品，无法发挥其更高分辨率的效果。同时FTICR-MS不仅操作复杂，维护也不是很方便。Thermo Scientific在2003年曾推出过FTICR-MS，但2005年推出Orbitrap后，我们自己放弃了FTICR-MS的生产线，因为FTICR-MS不能被更多人使用。” David Horn博士补充说：“我以前就是FTICR-MS的使用者，由于维护需要液氮液氦，根本无法断电，对于维护人员的神经是一个挑战。而Orbitrap对于我这样的FTICR-MS使用者来说，可以大大减轻我们的工作，因为它是即开即用的！不久前，我比较过Orbitrap Elite（分辨率高达24万）和FTICR-MS获得的数据，Orbitrap Elite的数据毫不逊色、而且更好。因此，即使对于能够操控FTICR-MS的专家们来说，使用Orbitrap，也能让他们更快、更方便地获得高质量的数据。”

　　定量蛋白试剂盒

　　在蛋白分析相关的试剂消耗品方面，Thermo Fisher Scientific都是直接在仪器上开发的。由于试剂和仪器时配套的，从而能够提高分析效率。例如细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术（SILAC）和串联质谱标签（tandem mass tag）试剂盒。

　　细胞培养氨基酸稳定同位素标记技术（SILAC）

SILAC的基本原理

　　SILAC技术的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定。

　　SILAC法弥补了质谱在定量方面的局限，与分析和生化处理过程具有很好的兼容性，SILAC法标记效率高、损失小；标记误差低，可靠性高。

　　串联质谱标签（tandem mass tag）TMT试剂盒

TMT试剂盒

　　赛默飞世尔科技推出的串联质谱标签（tandem mass tag）试剂盒，被称为TMT，用于标记实验。TMT包含带有氨基活性基团的等量的串联质量标签，一个质量归一化的连接子，一个可断裂的化学键，和报告离子 （reporter ion）系列。使用这些试剂，研究者们能够在一个样本中专门标记肽和蛋白，然后进行相对或绝对的定量。该方法能够分析一个样品中的每一个单独的蛋白，可同时最多分析6个样品。

　　蛋白质组学软件：击中目标

　　Proteome Discoverer软件

　　据David Horn先生博士介绍，蛋白质组学数据处理是非常复杂的，这里面有几个阶段：第一步就是把质谱原始数据转换为蛋白的鉴定结果。Thermo Scientific拥有的软件平台——Proteome Discoverer软件，这个软件有很多特点，其中一个最大的特点就是可以自己设置数据处理的流程或模式，有了这种功能，可以最大限度地发挥软件的功能。

　　Proteome Discoverer软件的推出和很多实验室进行合作，将他们的要求增加进去，该软件的很多功能来自客户的发明和创造，最新版本的Proteome Discoverer也获得了来自中国实验室的技术。

　　Proteome Discoverer既可以做定性，也可以做定量（包括同位素标记的定量和Label-Free的定量）。另外，一个主要的优点是可使用多个数据库搜索引擎，从多种裂解方法中分析信息，从而发现更多的翻译后修饰（PTMs），并提高多肽和蛋白鉴定的准确度。比如，在单次操作中，能同时分析CID（碰撞诱导解离）、ETD（电子转移解离）、HCD（高能C阱裂解）的数据，提供结果的序列、翻译后修饰和交叉确认信息。并且，从赛默飞世尔科技专有的、Z-Core算法（该算法分析由ETD产生的C-离子和Z-离子谱图）中获得的信息，能和CID谱图数据合并检索，在一个简单易读的格式中提高蛋白的覆盖率（protein coverage）。

　　ProteinCenter软件

　　 当我们得到了一个蛋白质鉴定的结果和定量的数据，这并没有完成整个数据处理。最终还是要将这些结果转化为生物学的应用。因此，如何对获得结果进行生物学意义的解释说明，Thermo Scientific ProteinCenter软件的推出则解决了上述问题。

　　ProteinCenter软件可以从一个非常大的蛋白数据库里获取数据，将质谱鉴定的结果解释为生物学上有意义的数据。该软件的特点是速度非常快，几分钟就能将鉴定的蛋白质在生物学上的意义进行阐释，将分析人员从先前大量的手工操作中解放出来。通过ProteinCenter软件，能得知蛋白的重要性，属于哪种类型，及其作用等等。

　　ProSightPC软件

　　另外一个在蛋白质组学处理部分较为重要的软件则是ProSightPC，该软件是Thermo比较有特色的产品，是与美国西北大学化学生物学家Neil Kelleher教授共同合作开发的。该软件主要针对自上而下（top-down）的蛋白质鉴定和表征而设计的，该软件无需酶切方法便可进行分析，从而得到蛋白异构体和更为完整的序列信息。

　　除此之外，赛默飞还提供PinPoint软件，可利用来自Orbitrap、Q-Exactive的高分辨准确质量的数据，加速开发定量实验的流程。SEIVE软件可快速帮助解析来自于差异表达蛋白质和多肽的数据。SimGlycan软件，可识别和表征更多蛋白质、肽和翻译后修饰（PTMs）。

　　 当问到这些软件在操作上，对实验室的计算能力有何要求时，Andreas FR Huhmer博士讲到，软件在设计方面有了很大的改进，新算法的不断推出，分析速度大幅度提高，对计算机的要求反而降低。Thermo Fisher Scientific的相关软件产品都装在PC里一同提供给用户，因此用户不用担心如何安装等问题。且数据库现在都建立在本地电脑上，高分辨数据对计算机的搜索速度要求是逐渐降低的，由于搜索窗口缩小，所以对计算的要求会更少，PC计算机就已足够。

　　定量低丰度蛋白生物标志物的增强型解决方案

　　转化医学领域目前遇到的瓶颈即为如何对大量的生物标志物进行验证，从分析的角度上看，如何检测到这些低丰度的蛋白，并且能够实现很好的重复性，是目前分析的一大挑战。赛默飞世尔科技提供的KingFisher Flex全自动磁珠提取纯化系统和MSIA技术（质谱免疫）都属于免疫亲和的纯化技术，和对生物样品中低丰度的蛋白质浓缩，是检测低丰度蛋白的必备工具。

　　MSIA技术（质谱免疫）

　　2011年，Thermo Fisher Scientific收购了蛋白质组学样品制备公司Intrinsic Bioprobes（http://www.antpedia.com/news/82/n-164882.html），该公司提供的ZL质谱免疫（MSIA，Mass Spectrometric Immunoassay）技术，通过通用的MSIA tips，可灵活定制由低到高不同通量的免疫分析，简化免疫富集的同时，提高回收率和重现性。据Huhmer博士介绍，MSIA技术就是在tip里装有树脂，通过专有设备在树脂上结合不同的抗体，能方便地对血浆样品进行目标蛋白的纯化和富集。

MSIA技术（质谱免疫）

　　MSIA技术能对生物样品中低丰度蛋白进行浓缩，可快速稳定地分析血浆样品中的生物标志物，得到高确信度的数据结果。比如通过MSIA技术，能够在Q-Exactive质谱系统上快速进行血浆中生物标志物的验证分析，并且获得很好的重复性，检测水平能够达到pg/L。

　　KingFisher Flex全自动磁珠提取纯化系统

KingFisher Flex全自动磁珠提取纯化系统

　　KingFisher Flex全自动磁珠提取纯化系统采用转移磁珠而非转移溶液的独特ZL原理，使得提取纯化效率大大提高。 该系统非常灵活，能够做到从20ul到5ml样品的自动化提取纯化。 对任何初始材料（从动植物样本、血液、土壤），可以提取纯化任何样品（从RNA、DNA、蛋白质到细胞），并得到高质量的产物。

　　采访最后，Andreas FR Huhmer博士再一次强调，Thermo Fisher Scientific在蛋白质组学领域的战略，就是继续保持创新，并将前处理产品、色谱产品、质谱产品、以及蛋白质组学数据处理软件产品更好地整合在一起，为用户提供从产品、服务、技术支持的功能强大的完整解决方案。

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