众所周知，比耳定律问世已230 多年了, 几乎所有的光学分析仪器分光光度计( 如紫外分光光度计、可见分光光度计、原子吸收分光光度计、液相色谱仪的紫外检测器等) 的原理都是采用比耳定律。
比耳定律是在假设照射到吸光物质上的光是严格的单色光, 被测物质是由独立的、彼此之间无相互作用的吸收粒子组成的前提下定义的。因此,
在实际工作中, 就必须要认真考虑这些问题, 才能真正掌握好比耳定律, 才能设计、制造出优质的紫外可见分光光度计等光学式分析仪器,
使用者才能用好这些光学式分析仪器。
一、比耳定律及其数学表达式
18 世纪初期, 朗伯在前人的基础上, 进一步研究了物质对光的吸收与物质厚度的关系, 并于1760 年指出: 如果溶液的浓度一定, 则光对物质的吸收程度与它通过的溶液厚度成正比。这就是朗伯定律, 其数学表达式为
式中, A 为吸光度; I0 为入射光强度; I 为透射光强度; b 为液层厚度(即光程) ; K0 为比例常数。
1852 年, 比耳研究了各种无机盐的水溶液对红光的吸收后指出: 光的吸收和光所遇到的吸光物质的数量有关; 如果吸光物质溶于不吸光的溶剂中,
则吸光度和吸光物质的浓度成正比。即当单色光通过液层厚度一定的有色溶液时, 溶液的吸光度与溶液的浓度成正比, 这就是比耳定律。其表达式为
式中, A 为吸光度; I0 为入射光强度; I 为透射光强度; C 为溶液的浓度; K1 为比例常数。
若将朗伯定律和比耳定律合并, 则为朗伯-比耳定律( Lambe rt-Bee r ) , 一般简称为比耳定律。它可用以下数学公式描述
式中, b 为光程; C为溶液的浓度; K2 为比例常数, 一般将K2 称为吸光系数, 单位为1/ ( g·cm) 。
式( 2-8 ) 中, 若将浓度C以摩尔( mol ) 浓度表示, 光程b 以厘米( cm)表示, 则吸光系数K2 称为摩尔吸光系数, 一般用ε表示, 其单位为1/ (mol·cm) 。此时, 式( 2-8 ) 可改写为
其中, ε是有色溶液在浓度C 为1mol/ L, 光程b 为1cm 时的吸光度;
它表征各种有色物质在一定波长下的特征常数, 它可以衡量显色反应的灵敏度;ε值越大, 表示该有色物质对此波长光的吸收能力越强,
显色反应越灵敏。一般ε的变化范围是10～105 , 其中ε> 104 为强度大的吸收, ε< 103 为强度小的吸收。
如果试样的分子量M 还不知道, 可用A1 %1 cm 来表示。
综上所述, 比耳定律可以描述为: 当一束平行的单色光通过某一均匀的有色溶液时, 溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的乘积成正比, 这就是比耳定律的真正物理意义。它是光度分析中定量分析的最基础、最根本的依据。也是紫外可见分光光度计的基本原理。
二、影响比耳定律偏离的主要因素
( 一) 非单色光
如前所述, 从理论上讲, 比耳定律只适用于单色光, 但在实际工作中并非如此, 绝对不可能从光学分析仪器上得到真正的单色光,
只能是得到波长范围很窄的光谱带。因此, 进入被测试样的光仍为在一定波段内的复合光。由于物质对不同波长的光具有不同的吸光程度,
故在实际工作中即使用很高级的分光光度计、采用很窄的光谱带宽, 即用波段很窄的复合光照射样品, 仍然会产生比耳定律偏离。
此时, A 与C 成线性关系。但实际上, ε是有色物质的与波长有关的特征常数,
对同一有色物质而言, 在其他条件一定时, 不同波长有不同的ε值, 故ε1 不可能完全与ε2 相等。因此, 对非单一波长的入射光, A 与C
不可能真正成线性关系, 因而产生了比耳定律偏离。
( 二) 杂散光
杂散光是紫外可见分光光度计的主要分析误差来源。杂散光产生的原因很多,
最主要的是光栅、外光路和单色器内壁散射等原因产生杂散光。仪器的杂散光80%来自光栅, 它使分析测试的吸光度变小, 特别在高浓度时,
杂散光的影响会更加严重, 以引起比耳定律的偏离。同时, 由于物质在某些介质中分散为许多微小的粒子, 这些粒子会对入射光产生散射。并且,
随着粒子浓度的增大, 这些散射光的强度会增强, 会降低透射光强度, 使被测试样的吸光度增大, 从而引起比耳定律的偏离。此外,
由于不少物质在光的照射下会产生光致发光现象或产生荧光, 也将严重影响比耳定律, 使之偏离。
( 三) 噪声
噪声会直接影响紫外可见分光光度计的信噪比, 降低仪器的灵敏度,
噪声限制紫外可见分光光度计仪器对样品分析浓度的下限。噪声主要来自仪器的电子学系统, 一般用峰-峰值来表示。如果仪器的正噪声大,
会使测定低浓度样品的吸光度值增大; 如果仪器的负噪声大, 就会使测定低浓度样品的吸光度值减小, 从而使测定值偏离比耳定律。
( 四) 光谱带宽
光谱带宽会直接影响比耳定律的偏离, 这是容易被人忽视而又特别重要的问题。本书将在后面详细介绍, 此不赘述。
( 五) 化学因素
化学分析中绝大多数是基于被测定成分与试剂之间的反应, 从而得到一定的反应产物。这个产物不一定很稳定, 有时还会继续产生化学反应、溶剂效应, 有时试剂中还有杂质等的干扰, 这些都会引起比耳定律的偏离。
( 六) 其他因素
除上述因素外, 分析测试时的温度也可引起比耳定律的偏离, 压力、光学传感器的非线性等, 也可引起比耳定律的偏离。
三、比耳定律的局限性与可靠性
( 一) 比耳定律的局限性
如前所述, 比耳定律在低浓度时是正确的, 但不排除在高浓度时, 采用差示分光光度法、多波长法等适当方式进行定量分析。
( 二) 比耳定律的可靠性
比耳定律假设的分析条件与实际的分析条件有偏离, 因此, 在使用中就会出现可靠性的问题。在比耳定律的推导中, 至少有三个假设是与实际不相符的:
第一, 假设采用的是单色光; 第二, 入射光是平行光; 第三, 吸光粒子(分子或离子) 的行为相互无关, 而且,
不论其数量和种类如何都是如此。此外, 样品的处理、测量过程中的仪器条件和操作等因素也会产生误差。由于有这些假设和操作上的原因,
引起了比耳定律应用中的可靠性问题。下面将对此进行简单分析讨论。
1. 非单色光
在比耳定律的推导中, 都是假设采用单色光,
而在实际中不可能是真正的单色光, 即使是选用仪器上设置的最小光谱带宽也是如此。非单色光的谱带宽度与使用仪器的光谱带宽有关, 所用的光谱带宽越大,
非单色光的谱带宽度就越大, 光谱纯度就越差。因此, 由于实际的非单色光与假设的单色光不符, 就产生了比耳定律的偏离。
假设入射到样品上的光是真正的平行光, 这在实际中也是不可能的。不管在何种情况下, 入射到样品上的光, 总是有一个孔径角。这与假设入射到样品上的光是平行光不符。因此, 产生了比耳定律的可靠性问题。
2. 吸光物质成分之间的相互作用
在比耳定律的推导中, 假设所有的吸光粒子( 分子或离子) 的行为都是相互无关的。但是, 这种情况只有在稀溶液(浓度≤0. 01mol/ L )
中才存在。因为在浓度增大时, 往往产生某些附加效应, 如聚集、聚合或缔合作用、水解以及络合物配位数的改变等, 最后影响物质的吸光效应。并且,
吸光粒子之间的相互作用必将改变吸光成分或被激发的成分, 或改变电荷分布。从而将改变对所吸收的入射光能量的要求,
导致吸收峰的位置、形状和高度随着浓度的增加而改变。
3. 光程不相等
比耳定律假设所有入射光线通过相同数量的吸收粒子或假设所有入射光线通过吸光物质的光程相等, 其实不然,
如果把一个样品放在几台不同的紫外可见分光光度计上测试, 尽管仪器都经过认真的调试、校验, 其测试结果都是不会相同的。其原因有多方面,
除前面所述因素的影响外, 还有以下因素引起光
如果光束的截面是均匀的, 那么, 从式( 2-13) 可以计算不同孔径角的吸收百分比误差。当孔径角小于5°时, 吸光度A 值的误差小于0. 1%。
(2 ) 比色皿引起的误差大 多数样品是以溶液形式进行分析测量的, 因此,
比色皿就成了重要部件。它的几何尺寸的加工误差、配对误差会直接导致分析测试结果产生误差。特别是比色皿的两个通光面之间的距离和平行性更是如此。英国标准研究所曾经介绍过关于比色皿的技术要求,
他们建议光程长的标准精度必须达到±0. 02mm , 端面窗的平行性是4 个光圈/ 1cm ( 用汞灯的546. 1nm 测试) ,
对于10mm 光程的比色皿, 其标定精度必须在±0. 01mm 内。
作者根据我国国家计量检定规程的要求,
对我国某公司生产的比色皿进行过测试。在三个月中( 其中间隔一个月) , 先后从两批产品中, 挑选62 对比色皿进行了配对检测。第一批挑选32
对比色皿, 不合格者达22 对, 占68. 8% ;第二批挑选30 对比色皿, 不合格者23 对, 占76.
6%。而该公司长期从事比色皿的生产, 用户遍布全国各地, 甚至大量出口国外。据该公司负责人讲,
从未听到过使用者对他们生产的比色皿提出过配对不合格的意见。这说明了广大科技人员,
尚未对比色皿的配对误差给紫外可见分光光度计的分析误差带来的严重影响引起重视。
当光线通过盛有溶液的比色皿时, 一部分在两个端面产生反射。
(3 ) 样品处理和测量过程中产生的误差不管测试什么样品,
总是要事先对样品进行处理。要对样品进行处理,
总会因为仪器设备等各种原因而带来误差。如称量天平的误差、取液的量筒或移液管等玻璃仪器的误差、仪器条件选择(
光谱带宽、扫描速度等)、环境因素(温度、电磁场的干扰等) 、人为操作误差等。这些误差都会引起比耳定律应用中出现的问题。