全自动酶标仪正确运用方法

作为微孔板比色计的全自动酶标仪，其底子功用不外乎一个比色测定，所纷歧样的是在测定波长规模、吸光度规模、光学体系、检测速度、震板功用、温度操控、定性和定量测定软件功用等方面的差异，当然全主动酶免疫剖析体系还具有主动洗板、温育、加样等功用。在临床试验室实践作业中，试验人员在运用全自动酶标仪进行测定操作时，有时不免会对全自动酶标仪的一些功能指

　　标发作利诱，甚至对全自动酶标仪的运用发作过错的知道。如比如运用全自动酶标仪较用肉眼调查测定的阳性率显着增加这样的疑问。

　　一、测定波长 通常全自动酶标仪的测定波长在400～750nm或800nm之间，完全可以满意ELISA的显色测定。当前国内常见的ELISA试剂盒所运用的符号用酶均为辣根过氧化物酶(HRP)，底物通常为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)，其在过氧化氢溶液的存鄙人，经HRP作用，别离氧化为2，2，—二氨基偶氮苯(DAB)和联苯醌。当pH值为5.0左右时，DAB在450nm波利益有zui大吸收，当pH值降为L 0时，zui大吸收波长移至492 nm，一起摩尔消光系数变大，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸停止反响。TMB的氧化产品联苯醌在波长450nm处有zui大消光系数，若是HRP量少，H：O：和TMB过量时，则构成蓝色的阳离子根。下降pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，运用硫酸作为停止剂可使产品安稳90min。因而，450nm和492 nm两个波长是当前ELISA测定zui常用的。各种全自动酶标仪都配有放置滤光片的可主动变换的部件，可以一起装置6～8片滤光片，所装备的滤光片均应包含上述两个波长，有的全自动酶标仪以490nm滤光片替代492nm滤光片，影响不大。除了这两个底子滤光片外，考虑到双波长比色的需求，还应有620nm或630nm或650nm和405nm波长的滤光片，其他滤光片可依据自个的需求挑选。有时，有的试验室期望用全自动酶标仪作微量生化测定，故全自动酶标仪出产厂家对其出产的全自动酶标仪拓展了紫外检测功用，此刻需求一个340 nm波长滤光片。此刻，全自动酶标仪的测定波长规模就变成340—750nm或800nm。

　　全自动酶标仪有单波长和双波长检测功用有时运用者不知在啥情况下运用单或双波长检测。所谓的“单波长”即是运用一种对显色具zui大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定;而“双波长”则除了用对显色具zui大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定外，一起用对特异显色不灵敏的波长如630 nm进行测定，全自动酶标仪zui终打印出来的吸光度则为二者之差。630 nm波长下得到的吸光度对错特异的，来自于板孑L上比如指纹、尘埃、脏物等所形成的的吸收。因而，在ELISA比色测定中，zui佳运用双波长，且不用设空白孔。

　　二、测定的吸光度规模 通常，全自动酶标仪的吸光度测定规模在。一2.5之间即可以满意ELISA的测定需求。前期的全自动酶标仪可测定的吸光度通常在。一2.5之间，但现在底子上都做了拓展，可到达3.5以上，并且能坚持极好的精细度与线性。如Labsystems公司Dragon Wellscan MK—2的吸光度测定规模为0—3.5，而Multiskan Ascent的吸光度测定规模(Abs)达0～4.0，在0～4.0规模，线性差错不超越±2.0%，在0.3—3.0吸光度规模内，测定精细度CV小于±0.2%;3.0～4.0Abs规模内，测定精细度CV小于士0.2%。因而，关于全自动酶标仪的吸光度规模不用去故意追求大的吸光度规模，首要要看在必定的吸光度规模内的线性和精细度怎么。

　　三、光学体系 全自动酶标仪的光学体系选用的是笔直光路多通道(通常为8或12通道，亦有单通道)检测，通常为硅光管或光导纤维，除测定通道外，有的全自动酶标仪还有一个参比通道，每次测定可进行自我校准。全自动酶标仪的光学体系功用怎么，均可经过全自动酶标仪测定的吸光度规模、线性度、精细度和精确度等表现出来。光学体系好的话，则上述方针也应较佳。测定的精细度与测定通道之间的均一性有直接关系。单通道可防止因通道纷歧样所形成的的差异。

　　四、检测速度 全自动酶标仪的检测速度是指其完结比色测定所需求的时刻。检测速度快，有利于进步检测的精细度，即防止因为测定进程中，因测守时刻纷歧样所形成的的各微孔间吸光度间的差异。当前市场上常见的全自动酶标仪检测速度都非常快，通常在数秒钟内，如Labsystems公司Dragon Wellscan MK-2和MK—3检测96孔只需2s(接连形式)或5s(步进形式)。Multiskan Ascent为单通道检测，亦只需9s(接连形式)或14s(步进形式)。又如BioRad公司的Benchmark的检测速度单波长为7s，双波长为15s。

　　五、震板功用 全自动酶标仪的震板功用是指全自动酶标仪在对ELISA板孔进行比色测定前对其进行振动混匀，使板孔内色彩均一。当前市场上常见的全自动酶标仪均有震板功用，所纷歧样的是震板方法，有的可按上下、左右或旋转等方法及振动起伏等恣意调理，如Labsystems的MK-2;有的则较为固定，如BioRad 550。运用有震板功用的全自动酶标仪，在进行ELISA测定显色反响完结参加停止剂后，可不用振动混匀，直接放人全自动酶标仪上测定即可。

　　六、温育功用 温育功用是指全自动酶标仪自身能按需求主动精确地操控仪器内部的温度，使得ELISA测定中微孔板条的温育进程可在仪器内部完结，而无需再外配温箱。当前，只要少部分全自动酶标仪具有此种功用，如Labsystems公司的Multiskan Ascent，BioRad公司的Benchmark和Biotek公司的ElxS08等。温育功用仅仅全自动酶标仪的一个附加功用，是不是具有并不能阐明全自动酶标仪层次的凹凸及仪器的好坏。作为试验室是不是挑选，则可依据自个试验室的条件及需求来决议。

　　七、软件功用 软件功用是指全自动酶标仪所具有的对ELISA定性和定量测定及其他测定方法如酶标动力学、紫外和凝聚等数据的核算剖析并陈述成果的功用。软件功用是中高档全自动酶标仪的一个非常重要的功用。若是硬件方面差异不大，则软件就变成断定全自动酶标仪好坏的专一方针。关于用户来说，好的软件功用，对实践作业会有较大的协助。ELISA定性测定，全自动酶标仪如具有阳性判别值(cut-off)及其测定“灰区”(即指测定吸光度处于cut—off周围的必定区域，此区域内成果应为“可疑”)的核算核算功用，不光方便了试验室作业人员，并且在某些特定的情况下，有很高的实用价值。如血站试验室为筛检献血员血进行HBsAg、抗HCV和抗HIV等的ELISA测守时，常会遇到测定吸光度处于cut-off邻近但又低于cut—off的血，依照试剂盒的规范，可判为阴性，血为合格血，可用于患者输血，但直觉通知咱们，这样的血如输给患者，致使输血后相应疾病发作的能够性较大，这是由ELISA现有的测定技能的不断定性所形成的，也即是ELISA测定的“灰区”的存在使得ELISA测定试剂盒cut-off的设定仅仅相对的精确，此刻的假阳性和假阴性呈现的能够性较低。因而，在血站筛检献血员血时，如以测定“灰区”的下限作为判别献血员血筛检不合格规范，就可以防止因“灰区”所形成的成果判别过错而导致输血后疾病发作的能够性。适宜的软件功用关于ELISA定量测定相同很重要。有研讨标明，四参数方程能较好地反映免疫测定的剂量反响曲线，zui为合适于定量酶免疫测定的曲线拟合。因而，如意图是定量测定，则在全自动酶标仪的软件功用中，zui佳要有这种曲线回归方程核算剖析功用。其他比如连点、直线等回归核算，则可依据全自动酶标仪的运用意图而定，如兼用于微量生化测定，则此类回归核算就很有必要。

　　此外，全自动酶标仪兼做酶标动力学、凝聚反响测定所需的软件是不是应具有，当然也应依据运用意图而定。因为此类软件通常都较为贵重，全自动酶标仪常别的独自按需装备，若是不是试验室特殊需求，就不用强求这种软件功用。

　　八、言语界面 通常进口的中高档全自动酶标仪人机对话多选用英文。这关于某些底层试验室能够会存在言语方面的艰难，然后难以zui大极限地发扬全自动酶标仪的作用。为处理这方面的疑问，已有一些全自动酶标仪选用了中文界面，如Labsystems的MK-3。这样就大大方便了广阔底层试验室技能人员的运用。

　　综上所述，虽然全自动酶标仪的开展极为疾速，种类繁复，功用也不断加强，但其zui底子的功用是不变的，即比色测定。大凡比色测定，其底子需求即是在必定吸光度规模内要有好的测定精确性、线性和精细性。相同的吸光度规模，测定的精确性、线性和精细性越好则全自动酶标仪亦越佳。

　　并且，因为用于全自动酶标仪比色测定的为多孔(通常为96孔)微孑L板条，为确保测定的孔间重复性，则测定速度也是一个较重要的功能方针。至于其他如震板、温育及有关的软件功用，则可依据各自试验室的需求去对比挑选。