1590 年荷兰人米德尔堡和詹森设计制造了最原始的显微镜（图1），1610 年伽利略使用望远镜观察小的物体并将其放大，后来被列文霍克改进成为原始的显微镜。1658 年意大利人马尔皮基应用最原始的显微镜首先观察到了红细胞，他是第一个见到红细胞的人，开始进行红细胞计数则是200 年后的事情了。而设计并生产出第一台血细胞计数仪则又过了近100 年。
自从发明了显微镜以后，人们从微观世界中了解和观察到了血液的组成，并根据他们的特点分别将它们称为红细胞和白细胞和血小板。在以后的研究中，人们发现许多疾病的发生和发展与血液中的细胞数量之间存在一定的关系。依据对疾病诊断的需求，人们开始寻求对血液中细胞的数量进行计数。1852 年就有人开始设计对红细胞的计数办法，1855 年发明了用于计数血细胞的计数板， 目前仍然使用的改良Neubauer 计数板就是应用最为广泛和持续时间最为长久的经典一种，虽然各种类型的血细胞计数仪已在广泛使用，但血细胞计数板法仍然是最为可靠和最为经典的计数技术，它不仅适用于血细胞计数， 还可用于其他细胞、动物血细胞、微小粒子及需要在显微镜下计数的各种样品，因此计数板仍然是检验工作者应该掌握的基本技能，是不应该忘记和放弃的手段。
随着对血细胞计数和分析需求的不断增加，对血细胞计数的方法进行改进，实现自动化、高速度、准确性、标准化和智能化的要求也越来越高，现代的血液细胞分析技术与50 年前的发明虽然有着本质上的相同或相似，但已经有了显著的飞跃。作者力图通过有限的资料对细胞计数和分析技术的发展进程进行回顾，并对最新的进展进行介绍和展望，期望对关注这一领域和从事血细胞分析工作的同行有所帮助。
一、血细胞计数仪的发展历史
谈到血细胞计数仪的发展史，在这个领域首开先河的人是1912 年出生在美国阿肯色州一个小城的人Wallance H. Coulter （图2a，b），他年青时对电子学非常感兴趣，最初是一位广播电台的电器工程师，后来做过X光机的销售员和维修工程师，在亚洲许多国家包括我国的上海工作过。1948 年他在芝加哥一家公司工作时，在一间地下室建立了自己的实验室，开始秘密的从事自己的实验，这项实验导致了一个重大的发明，他发现了微小粒子通过特殊的小孔时可产生电阻变化这一现象，并根 据这种电阻变化特点将其应用于微小粒子的粒度测量和计数上。科技界为表彰他的发明，将其称为库尔特原理（Coulter principle ）。根据这个原理，Coulter 先生将其引入到血液细胞计数上，在1953 年获得美国发明ZL，同年和他的兄弟约瑟夫（Joseph ）开创了自己的公司，并成功的设计和制造出了可以计数血细胞的专用仪器，然后开始了在这一领域的商业运作。这种仪器看起来非常原始和简单，好象一个示波器另加一些管道、电极和瓶瓶罐罐（ 图3） 。它的计数原理是根据血细胞的不良导电性和产生电阻抗原理来计数血液中的细胞，也就是电阻式血细胞计数原理，这种原理现在已经成为血细胞计数和分析中最为经典的原理。
最初的血细胞计数仪是一种单参数测定仪器，只能对血液中的红细胞和白细胞进行计数，并且需人工切换。最早生产的血球计数仪为Coulter A型，笔者曾经见到和使用过Coulter D型，那是一个黑色外壳的长方型仪器，它的前面有一些调节轮盘，右下方有一个可以升降的样品台，它通过U型水银管控制计数时间和计数容量，外侧安装有一个窥孔器（用于观察计数小孔是否有堵塞的放大镜），通过数码管显示结果，通过切换按键选择白细胞还是红细胞计数的简单仪器。1958 年以Coulter 命名的专门从事颗粒性测量和计数的仪器公司，库尔特电子（Coulter Electronics ）公司成立。
此后，欧洲、日本也开始了血液细胞计数仪的开发和研制,我国在60年代中期也开始了这种仪器的开发和生产。例如日本Sysmex 公司1962 年就生产了可进行红细胞和白细胞计数的CC-1001 型血球计数仪，我国1965年在上海也生产了简单的血细胞计数仪，1975 年北京医疗仪器厂也开始模仿设计自己的简单的红白细胞计数仪。到目前为止已经有许多国家开始生产各种类型的血细胞分析仪，经过半个多世纪的发展，这种仪器已经有了非常明显的进步。以前因为只能进行细胞计数，因此我们一般将这类仪器叫做血细胞计数仪（Blood Cell Counter）,由于技术的进步目前这类仪器可以提供除了血细胞计数以外的更多参数的联合测定和分析，因此我们一般将这类仪器统称为血液细胞分析仪(Hematology Analyzer) 。
经过多年的发展，特别是近年来电子计算机技术的发展，血细胞分析仪无论在技术上、形式上、功能上、参数上、用户界面上等许多方面都有很大的改观和进步。
因人所共知的原因，我国和美国在50年代基本没有任何贸易往来，因此英国进口的EEL型血球计数仪应该是国内引进比较早的血球计数仪。协和医院检验科在60 年代初期就引进了这样一台仪器，该仪器是具有代表性的早期采用光学的细胞移动型血细胞计数的仪器，也是最早使用光学法和壳流技术的仪器。血细胞在流动的壳液的带动下经过光轴的中心，在暗视野下呈现出明亮的光脉冲信号，通过对这个信号的收集和分析来计数血细胞。该仪器的特别之处是稀释倍数和人工计数法一致，当仪器出现故障时，将标本滴入计算板仍可实施人工计数。该仪器体积较大，并缺乏备件，在80年代初期停止了使用，遗憾的是笔者没有找到该仪器的资料照片。
二、血细胞分析仪发展中的技术进步
随着各种技术的不断进步以及实验室工作对仪器设备需求的不断增加， 血细胞分析仪的各项用途和用法也有不断的进展，这首先体现在仪器应用的方便性、准确性和尽可能增加的参数上。
1、稀释技术的进步： 早期的仪器一般要求在测定前先进行人工稀释，因此许多操作要求直接取20～40ul 的末梢血加到稀释液中。白细胞稀释比例多在1：251 和1： 501倍，红细胞则需要进行二次稀释， 稀释倍数在6.25～25万倍之间， 然后再将稀释好的标本放入计数杯内进行计数，而且需要在白细胞稀释悬液中加入溶血剂。由于人工稀释费时费力且精确性差，随后的一些血细胞计数仪增加配置了专用的稀释器， 专供该型号的仪器进行机外稀释，这样减少了人工稀释带来的误差和麻烦，提高了效率。这类仪器的典型例子有国内应用非常普遍的SysmexF820 型（图4）， 此型号仪器到目前仍有市场需求并在广泛使用。现代的血细胞分析仪则更加先进，已经将自动稀释技术，自动进样方式全部添加到仪器本体内，即提高了技术含量、取样和稀释的精确度，使得进样的速度和可操作性更加方便，同时使得检测速度加快。
2、分析参数的增加：前面谈到早期的血球计数仪仅能进行红白细胞计数， 而且是需要通过切换分别进行红白细胞得计数， 所以将其称为血细胞计数器是恰当得。由于血常规检验对血红蛋白测定的需求增加，沙利比色法由于精度和操作不便不能满足临床需求，已经有单独的血红蛋白比色计配备，将加入专用的溶血剂后的样本进行白细胞计数后再将其倒入血红蛋白比色计， 即可得到比色法测定的血红蛋白结果。此时期国内使用最多的血细胞计数仪是Coulter ZF 型和血红蛋白计（图5）。由于对血红蛋白测定要求的增加，因此在仪器内增加一套比色装置，就可方便的测定血红蛋白。电阻法定细胞数量的同时还可对细胞体积进行测定，因此对红细胞平均体积（MCV）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）测定和计算也成为血球计数仪的标准参数。1975 年日本东亚公司（TOA， Sysmex 的前身） 推出了包含以上7 个参数的全自动血细胞计数仪器CC－710 和CC －720 型。
3、血小板计数功能的增加：血小板是血细胞中最小的粒子，早期的血细胞计数仪均不包含血小板计数。60 年代起国外开始研制血小板计数仪，70 年已经有比较成熟的产品，这类仪器一般需使用PRP 血浆进行， 即使用特殊的离心速度将红细胞和白细胞进行沉淀，使上层血浆中尽量保存最为丰富的血小板，然后应用这种PRP 血浆进行血小板计数，例如Sysmex PA-701 型和CONTRAVE 1000 型，此类仪器多配有专用PRP 离心机（图6 为TOA PLT-100 型血小板计数仪和离心机）。使用全血方式和水动力聚集方式计数血小板的仪器如Clay-Adams 的Ultra-Flo100 型以及80 年代后出现在我国的Baker S-810 型血小板分析仪（图7 为作者15 年前应用Baker S-810 型血小板分析仪的工作照片），该仪器设定了单独血小板分析测量通道，根据红细胞和血小板体积的显著差异他们区分开（图8），将血小板按体积大小划分到64 个通道，分别累加体积大小不同的血小板数量。它通过直接吸入稀释好的血细胞悬液进行测定，除了给出血小板数量外，还提供了两个新的参数，平均血小板体积(MPV) 和血小板体积分布宽度（PDW）。在这之后血细胞分析仪将血小板计数这一重要功能合并到全血细胞计数（CBC） 范围内。当时的仪器有很多型号，例如Baker 8000, Sysmex CC-800,Coulter S 系列和T 系列等。
3、定量部的改进：仪器为了准确进行细胞计数，除了要准确稀释血液外， 对直接进入计数小孔内的液体量也要进行定量控制，因此仪器对定量部的要求是非常严格的。在血细胞计数仪开始阶段， 人们设计了U型水银管压力计，通过水银的重量和在两个电极间的距离来控制吸入的标本量。后来人们通过两只光电管来了解液体通过一个固定距离所需要的时间和容积来控制标本的吸入量，还有一些公司设计并使用了微量注射器技术以及浮球定量技术来控制计数样本的量。最新的光电计时容量控制技术控制标本进入计数区的量，可以使得进入计数区域的细胞悬液定量更加准确和无污染、同时还可判断小孔是否出现堵塞或半堵塞问题，以及便于维护。
4、自动取样技术： 由于仪器需要对全血进行自动取样和稀释， 因此取样量也同样需要精确控制。最初的仪器是需要进行手工取样和稀释的，后来逐渐有了外置式专用取样稀释器。再后来仪器内部设置了内置式负压取样稀释器，根据负压量的大小来吸取血液样品，这对控制负压的精确度要求很高，此外还有微量注射器取样技术，依靠光电管控制血液取样量的技术等。目前认为采用旋转阀取样技术是比较精确的方法，旋转伐内部有多个按一定体积设计的小孔，当血液进而后，旋转伐从吸入的小孔转向排出的小孔，此时血液不能再进入，而孔内保留的固定量的血液进入仪器的稀释部，然后清洗，再进入下一次循环。目前许多更加先进的血液分析仪均采用陶瓷制的旋转阀来分配血液标本。
进样方式也从最初的单一预稀释方式，演化为预稀释和全血方式两者兼有。现在许多先进的五分类血液分析仪还采用了更多种进样方式，例如Sysmex XE-2100 和Bayer Advia 120 型，如末梢血方式、开盖手工进样、闭盖手工进样、急诊检验进样、全自动进样等方式以及连接到全自动流水线的自动进样技术等。进样设备有的采用旋转式进样盘，如MEDONIC CA570 （图9）和SWELAB AC920/970, 这种旋转式进样器多是选配件。更多的血液分析仪采用了平推式的自动进样系统，即将待检样品插在专用试管架上，仪器将试管架一步步送入仪器的取样口，测定完毕后自动推出。平推式自动进样系统在有些厂家的仪器上是可选择的配件，而在某些仪器上则是必备件。
5、仪器的清洗技术：最初的仪器的清洗靠人工浸泡或使用毛涮清洗，如果测定完一个很高值的标本，则需要用空白液清洗一下，以防止对下一个标本的携带污染。而现在许多仪器在完成一个标本的检测后可自动对计数小孔、管道进行冲洗，还可同时对取样器、稀释器、取样针内外进行全面清洗，减少交叉污染的机会。许多仪器在开机和关机时可自动执行清洗程序或按事先设定的清洗程序进行定时清洗，保证仪器正常工作。
6、小孔管技术的改进：小孔管是血细胞分析仪进行计数的关键部件，早期的仪器一般仅有一个直径为100μ的小孔管，多使用宝石经过激光精确打孔，然后镶嵌再玻璃支撑物上。现在多数电阻法仪器的小孔管在白细胞检测上使用直径为100 μ的小孔管，在红细胞和血小板检测上使用直径为60～ 80μ的小孔管，材料有宝石和特殊陶瓷等构成。例如经典的COULTER 外置式小孔管，当发生堵孔时可用毛刷清理或直接拆下来清洗（图10）。早期的小孔管一般暴露在外边，其主要目的是便于人工清洗，多为单管方式，进行白细胞到红细胞计数转换时最好清洗一下。后来发展为红细胞和白细胞各自独立的两个暴露在外的小孔管（图11），一般20秒即可同时完成红细胞和白细胞的计数，需人工使用加样器或定量吸管从白细胞稀释悬液中进行红细胞的二次稀释或使用配套的稀释器。目前的仪器小孔一般采用内置式，减少了污染的机会并同时提供了自动清洗功能，使得每次计数后都能提供自动冲洗，减少了交叉污染的机会同时计数的速度也有了很大提高。
为了更加准确的对细胞计数和防止各种干扰发生，各公司在小孔管的改进和设计上使用了不同的处理方案。这些技术有力的保证细胞计数准确，特别是血小板计数的准确性。
（1）扫流技术（Sweep Flow）： 为减少已通过计数小孔后由于液流的回流而重新返回计数区造成重复计数，在小孔后面增加一个扫流液系统，将计数过的细胞通过扫流液冲进废液管道。（图12）
（2）防反流装置（Von Behrens）： 为防止细胞返回到计数敏感区，在小孔后面加一个带孔的当板，用负压将已经计数过的细胞阻挡后直接收集到废液管道中。（图13）
（3）水动力聚焦技术（Hydrodinamic Focusing）： 是目前认为最为有效的方法，也叫鞘流技术。它利用流体动力学原理，即可保证细胞位于鞘液中心并排成一列通过检测孔中心或通过激光束中心，又保证它不会返回敏感区，目前许多较为高级的血液分析仪一般采用此种技术（图14）。